陳 鵬，李 波，彭 智，高 淦，陳 盛

(1.貴州省人民醫(yī)院骨科，貴陽(yáng) 550002；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院兒科，重慶 400038)

骨科植入物感染的發(fā)生率雖然較低，但是感染易依附植入材料形成生物膜，使感染遷延難愈導(dǎo)致感染治療的失敗[1-2]。表皮葡萄球菌是骨科植入物感染的最常見(jiàn)病原菌[3]，其黏附和生物膜形成能力是致病能力的重要因素，將直接影響到治療結(jié)果。而ica操縱子合成的胞間多糖黏附素(polysaccharide intercellular adhesion，PIA)是其黏附和生物膜形成的關(guān)鍵因素。有研究表明ica操縱子對(duì)細(xì)菌的黏附和生物膜形成能力均具有重要影響[4-5]，但目前尚未見(jiàn)有對(duì)骨科植入物及其黏附能力及生物膜形成能力的報(bào)道，據(jù)此本研究擬以臨床分離株為研究對(duì)象，探討ica操縱子基因表達(dá)對(duì)細(xì)菌在不同骨科植入物表面黏附和生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源和材料 17株表皮葡萄球菌中7株來(lái)源于貴州省人民醫(yī)院的植入物感染分離株，10株來(lái)源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科植入物感染分離株。骨組織、鈦合金和不銹鋼生物材料被切割成直徑為10 mm，厚度為2 mm的圓盤(pán)形狀。骨組織材料采用新西蘭白兔的脊椎骨，用蒸餾水沖洗去除骨髓內(nèi)容物，然后在室溫用含0.1%乙二胺四乙酸(EDTA) 的1× 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，70%乙醇和紫外線滅菌處理后在DMEM培養(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)菌檢查，孵育2周以排除培養(yǎng)基中的任何其他細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2試劑和儀器 血瓊脂平板購(gòu)自重慶龐通公司，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DNA、RNA提取試劑盒和瓊脂糖購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，2×Es Taq MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green MasterMix購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司，三通道Flowcell購(gòu)于美國(guó)IBI Scientific公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司，PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，ica A、D、B、C基因引物[6]由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.3方法

1.3.1表皮葡萄球菌ica操縱子的基因檢測(cè) 表皮葡萄球菌劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。從平板上挑取一個(gè)單菌落于10 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。細(xì)菌DNA提取按照DNA提取純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。20 μL PCR反應(yīng)體系：2×Es Taq MasterMix 10.0 μL，DNA 0.4 μL，上、下游引物各0.3 μL，ddH2O 9.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完畢，取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.2表皮葡萄球菌icaADBC操縱子基因表達(dá)分析 采用熒光定量PCR檢測(cè)表皮葡萄球菌icaADBC基因表達(dá)情況。采用Trizol試劑提取細(xì)菌總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Green 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增條件：首先94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后以16S rRNA作為內(nèi)參、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984作為對(duì)照進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.3表皮葡萄球菌PIA水平測(cè)定 PIA水平檢測(cè)采用苯酚-硫酸法[7]。按1%接種量將表皮葡萄球菌過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 8 h。4 ℃、4 000 r/min條件下將菌液離心15 min并棄掉上清液。用蒸餾水重懸菌體，加入37%甲醛300 μL，4 ℃保存3 h。然后加入1 mol/L NaOH 20 mL，4 ℃再次保存3 h。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸除上清液，留取沉淀待查。首先用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作為底物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)沉淀稀釋后按同樣的方法進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度(OD)值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的PIA水平。

1.3.4表皮葡萄球菌對(duì)不同生物材料的黏附能力分析 采用菌落平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)表皮葡萄球菌的黏附能力[8]。取表皮葡萄球菌過(guò)夜培養(yǎng)物100 μL轉(zhuǎn)種于10 mL TSB肉湯中，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。然后將菌液用TSB培養(yǎng)基調(diào)整至1×107CFU/mL。將3種無(wú)菌的生物材料圓盤(pán)放入Flowcell孔道，每個(gè)孔道中加入200 μL菌液，共3個(gè)通道，靜置培養(yǎng)1 h。上游儲(chǔ)液瓶中加入TSB培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基充滿(mǎn)整個(gè)流動(dòng)管，待靜置完畢后，啟動(dòng)Flowcell蠕動(dòng)泵，4.2 mL/h流速，37 ℃培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)完畢，取出生物材料放入無(wú)菌的24孔板中，加入1 mL PBS輕柔沖洗2次。然后再加入PBS超聲處理5 min，使黏附的細(xì)胞脫落。最后按10倍稀釋法將細(xì)胞懸浮液稀釋至合適的倍數(shù)后，取100 μL菌液涂布于TSB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5表皮葡萄球菌對(duì)不同生物材料的生物膜形成能力分析 取表皮葡萄球菌過(guò)夜培養(yǎng)物100 μL轉(zhuǎn)種于10 mL TSB肉湯中，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。然后將菌液用TSB培養(yǎng)基調(diào)整至1×107CFU/mL。Flowcell每個(gè)孔道中加入200 μL菌液，共3個(gè)通道，靜置培養(yǎng)1 h。上游儲(chǔ)液瓶中加入TSB培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基充滿(mǎn)整個(gè)流動(dòng)管，待靜置完畢后，啟動(dòng)Flowcell蠕動(dòng)泵，4.2 mL/h流速，37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完畢，取出生物材料放入無(wú)菌的24孔板中，每孔加入1 mL PBS輕柔沖洗2次后，在通風(fēng)陰涼處風(fēng)干。然后每孔加入1 mL 1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，自來(lái)水沖洗干凈后，于通風(fēng)陰涼處再次風(fēng)干。最后每孔加入30%冰乙酸500 μL進(jìn)行溶解，取100 μL在酶標(biāo)儀590 nm處測(cè)定OD值。

2 結(jié) 果

2.1表皮葡萄球菌ica操縱子的基因檢測(cè) 17株表皮葡萄球菌臨床菌株中，SE157、SE159、SE160、SE162、SE164、SE165、SE166、SE167、SE169、SE171、SE172 共11株菌株攜帶icaADBC 4種基因，其他6株擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

2.2表皮葡萄球菌ica操縱子基因表達(dá)分析 11株ica操縱子基因陽(yáng)性菌株的基因表達(dá)情況如圖1所示。所有臨床菌株icaADBC 4種基因均有不同程度的表達(dá)，且其基因表達(dá)均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984。

圖1 表皮葡萄球菌icaADBC操縱子基因表達(dá)

2.3表皮葡萄球菌PIA水平測(cè)定 ica操縱子基因陽(yáng)性菌株P(guān)IA水平測(cè)定結(jié)果如圖2所示。所有臨床菌株P(guān)IA表達(dá)水平均大于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984，且ica操縱子基因表達(dá)水平高的菌株其PIA表達(dá)水平也高，即PIA表達(dá)水平與ica操縱子基因表達(dá)水平一致。

圖2 表皮葡萄球菌PIA水平測(cè)定

2.4表皮葡萄球菌對(duì)不同生物材料的黏附能力分析 表皮葡萄球菌在不同生物材料上的黏附能力見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，表皮葡萄球菌菌株對(duì)骨組織的黏附能力最強(qiáng)，對(duì)鈦合金的黏附能力大于不銹鋼金屬材料。此外，17株臨床菌株對(duì)3種生物材料的黏附能力均大于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984。

表1 表皮葡萄球菌在不同生物材料上的黏附能力

續(xù)表1 表皮葡萄球菌在不同生物材料上的黏附能力

2.5表皮葡萄球菌對(duì)不同生物材料的生物膜形成能力分析 所有表皮葡萄球菌菌株在骨組織上的生物膜形成能力最強(qiáng)，且在鈦合金上的生物膜形成能力高于不銹鋼。此外，所有臨床菌株的生物膜形成能力均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984，見(jiàn)圖3。

圖3 表皮葡萄球菌在不同生物材料的生物膜形成能力

2.6表皮葡萄球菌icaA基因表達(dá)與生物膜形成能力的相關(guān)性分析 通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)分析icaA基因表達(dá)與細(xì)菌生物膜的相關(guān)性，結(jié)果顯示，11株icaA陽(yáng)性菌株基因表達(dá)與其在不銹鋼、鈦合金及骨組織上的生物膜形成之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.891、0.700、0.627，P=0.000、0.016、0.039)。

3 討 論

表皮葡萄球菌是細(xì)菌生物膜感染的最常見(jiàn)菌株之一，是骨科移植物和導(dǎo)管感染中首要病原菌[9-10]。生物膜主要由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)構(gòu)成，而胞外基質(zhì)包括胞外多糖、各種蛋白等[11]。PIA是表皮葡萄球菌生物膜形成聚集階段最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。表皮葡萄球菌ica操縱子基因座包括調(diào)節(jié)基因icaR及串聯(lián)存在的icaA、icaD、icaB和icaC 4個(gè)基因。icaA、icaD、icaB、icaC基因構(gòu)成一個(gè)操縱子,共同完成PIA的合成，因此可以通過(guò)檢測(cè)icaA、icaD、icaB、icaC基因來(lái)反映ica操縱子的存在[13]。本研究分別擴(kuò)增icaA、icaD、icaB、icaC操縱子中的4個(gè)基因發(fā)現(xiàn)該操縱子無(wú)單個(gè)基因缺失的情況存在，與國(guó)外報(bào)道一致[14]。有研究表明血液、導(dǎo)管、人工關(guān)節(jié)分離的表皮葡萄球菌中ica操縱子檢出率明顯高于正常皮膚黏膜來(lái)源的菌株[15-16]。本研究中有11株(73%)ica操縱子表達(dá)陽(yáng)性，高于文獻(xiàn)報(bào)道的16.5%～53.4%[17-18]，筆者認(rèn)為這種差異可能是病原菌來(lái)源不同導(dǎo)致的，由于本研究的菌株均來(lái)源于骨科生物材料相關(guān)感染且藥物治療失敗的患者，該類(lèi)菌可能具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，因此具有較高的ica操縱子攜帶比例。此外，本研究中并未發(fā)現(xiàn)攜帶ica操縱子基因但是并不表達(dá)PIA的菌株，且ica操縱子基因表達(dá)高的菌株其PIA表達(dá)水平也較高，表明ica操縱子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與PIA的表達(dá)水平密切相關(guān)，ica操縱子基因通過(guò)調(diào)節(jié)PIA表達(dá)水平來(lái)影響細(xì)菌生物膜的形成。表皮葡萄球菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制包括icaADBC依賴(lài)和非icaADBC依賴(lài)兩種途徑。本研究中ica操縱子基因的表達(dá)與細(xì)菌在3種材料上生物膜形成能力相關(guān)，但是并非icaA高表達(dá)的菌株就有較強(qiáng)的生物膜形成能力，提示ica操縱子在細(xì)菌生物膜形成過(guò)程中具有重要作用，但不是惟一因素，可能還有其他基因及其產(chǎn)物對(duì)生物膜形成和PIA合成有重要作用。

本研究對(duì)臨床分離表皮葡萄球菌黏附和生物膜的觀察采用了“流室法”(Flowcell)，該方法具有可連續(xù)觀察細(xì)菌生物膜形成過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)，且在流動(dòng)的液體培養(yǎng)基的沖刷作用下，因沉積附于生物膜的細(xì)菌會(huì)被培養(yǎng)基帶走，而避免了浮游菌大量沉積對(duì)生物膜形成的影響，同時(shí)避免了細(xì)菌沉積生物膜表面導(dǎo)致對(duì)生物膜形成檢測(cè)結(jié)果的影響[19]。本研究中同組別細(xì)菌生物膜形成差異較小，表明Flowcell研究生物膜形成的方法具有結(jié)果穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)，因此在國(guó)外應(yīng)用極其廣泛，但國(guó)內(nèi)配套儀器不足和配套耗材較貴，在國(guó)內(nèi)研究報(bào)道較少。

研究發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984比較，骨科植入物相關(guān)感染表皮葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附和生物膜形成能力，尤其對(duì)骨組織具有較強(qiáng)的黏附和生物膜形成能力，對(duì)鈦的黏附和生物膜形成能力均強(qiáng)于不銹鋼，與文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道一致。骨組織在處理后由于粗糙并存在小孔，可能是導(dǎo)致表皮葡萄球菌易于黏附的主要原因。但是在體內(nèi)由于免疫細(xì)胞和免疫分子可在骨組織中分布，因此體內(nèi)外的結(jié)果可能會(huì)有不同，本研究為臨床骨科材料的使用提供了理論依據(jù)。

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