曾慶鐘，劉 穎，鄶一賀，劉敏鋒，易夢娟，王麗京，顧取良△

(廣東藥科大學(xué)：1.藥學(xué)院；2.基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)制未明的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)，以腹痛、腹瀉、里急后重和黏液膿血便等為主要癥狀，伴隨周期性結(jié)腸黏膜潰瘍、黏膜壞死和再生等病理學(xué)改變[1]。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在IBD發(fā)病過程中的重要作用受到很多研究關(guān)注[2-3]。冬凌草甲素是從我國傳統(tǒng)藥材冬凌草中提取出來的一種貝殼杉烯二萜類物質(zhì)，具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗菌、抗氧化及抗腫瘤作用等[4]。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素片對醋酸誘導(dǎo)的小鼠UC具有防治作用，但缺少相應(yīng)分子機(jī)制方面的研究[5]。本研究從ERS的角度探討冬凌草甲素對小鼠UC的防治效果及其作用機(jī)制。

表1 PCR引物序列

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周齡C57BL/6雄性小鼠40只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt，DSS)購自美國MP Biomedicals公司，冬凌草甲素購自中國生物藥品生物制品檢定所，柳氮磺胺吡啶購自美國Sigma公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，RT-qPCR引物由上海生工合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Roche公司 LightCycler?96型號。

1.2方法

1.2.1UC模型制備及藥物干預(yù) 將40只小鼠分為4組，即健康組(NOR)、模型組(DSS+生理鹽水)、冬凌草甲素干預(yù)組(DSS+冬凌草甲素)、柳氮磺胺吡啶干預(yù)組(DSS+柳氮磺胺吡啶)，每組10只。參照文獻(xiàn)[6]的方法建立急性UC模型，即配制2% DSS水溶液供除健康組以外的實(shí)驗(yàn)小鼠自由飲用，連續(xù)飲用7 d，每2天更換1次新鮮DSS水溶液；健康組小鼠飲用正常無菌水。實(shí)驗(yàn)期間每天灌胃給藥，冬凌草甲素劑量為15 mg·kg-1·d-1，柳氮磺胺吡啶劑量為500 mg·kg-1·d-1，模型組與健康組給予生理鹽水20 mL·kg-1·d-1。

1.2.2疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分 實(shí)驗(yàn)期間每天監(jiān)測小鼠的體質(zhì)量變化，觀察大便性狀，有無血便，有無隱血，按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行DAI評分。

1.2.3結(jié)腸病理觀察及組織病理形態(tài)學(xué)評分(histopathological score，HPS) 實(shí)驗(yàn)第7天給藥2 h后麻醉?xiàng)l件下脫臼法處死小鼠，取小鼠結(jié)直腸，測量其長度。末端結(jié)直腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋等常規(guī)程序后，組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)并按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行病理評分。

1.2.4RT-qPCR法檢測結(jié)腸組織腸道上皮組織中相關(guān)因子的表達(dá) 分離各組小鼠的結(jié)腸上皮組織，用TRIzol試劑分別提取各組小鼠結(jié)腸上皮組織的總RNA并用紫外分光光度法測定純度與濃度。按照RT-qPCR試劑盒說明書操作，檢測腫瘤壞死因子-α(tumor factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interkekin-6,IL-6)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(proteins glucose-regulated protein 78 kD,GRP78)、轉(zhuǎn)錄因子EBP同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)、激活性轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)及肌醇酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)mRNA的表達(dá)。各指標(biāo)RT-qPCR引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1DAI評分及結(jié)直腸長度 與健康組比較，建模第7天時(shí)DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠的體質(zhì)量明顯下降，出現(xiàn)腹瀉、隱血或便血等典型UC癥狀，DAI評分明顯高于健康組(P<0.01)。與未經(jīng)干預(yù)的模型組相比，冬凌草甲素干預(yù)組與柳氮磺胺吡啶干預(yù)組的UC癥狀均有所減輕，DAI評分明顯降低(P<0.01)，兩個藥物干預(yù)組之間DAI評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。取結(jié)直腸測量其長度，模型組結(jié)直腸較健康組明顯縮短(P<0.01)，冬凌草甲素干預(yù)組與柳氮磺胺吡啶干預(yù)組能明顯減少結(jié)直腸縮短程度(P<0.05，P<0.01)，不過柳氮磺胺吡啶的效果更顯著，見圖1。

2.2結(jié)腸HPS 建模第7天取結(jié)直腸進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察，健康組的結(jié)腸組織與腺體結(jié)構(gòu)完整(圖2A)；模型組結(jié)腸黏膜則出現(xiàn)大量腺體溶解及大量的炎癥細(xì)胞浸潤，并伴有明顯的潰瘍(圖2B)；冬凌草甲素干預(yù)組與柳氮磺胺吡啶干預(yù)組結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)較為完整，有少量潰瘍，部分腺體溶解(圖2C和2D)。與健康組相比，模型組HPS明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，冬凌草甲素干預(yù)組與柳氮磺胺吡啶干預(yù)組的HPS明顯降低(P<0.01)，且兩個藥物干預(yù)組之間HPS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2E。

2.3結(jié)腸上皮組織TNF-α、IL-6與COX-2 mRNA的表達(dá)變化 與健康組相比，模型組結(jié)腸上皮組織中TNF-α、IL-6及COX-2 mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，冬凌草甲素干預(yù)組TNF-α、IL-6及COX-2 mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；盡管柳氮磺胺吡啶對COX-2 mRNA表達(dá)水平的影響更明顯(P<0.05)，但兩個藥物干預(yù)組之間TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4結(jié)腸上皮組織GRP78、CHOP、IRE1α、ATF6與PERK mRNA的表達(dá)變化 與健康組相比，模型組結(jié)腸上皮組織中GRP78、IRE1α、PERK、ATF6及CHOP mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，冬凌草甲素干預(yù)組GRP78、ATF6、CHOP及PERK mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，但I(xiàn)RE1α mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而較柳氮磺胺吡啶干預(yù)組IRE1α mRNA表達(dá)水平有明顯上調(diào)(P<0.01),見圖4。

a：P<0.05,b：P<0.01

圖1各組小鼠的DAI評分與結(jié)直腸長度

A：健康組；B：模型組；C：冬凌草甲素干預(yù)組；D：柳氮磺胺吡啶干預(yù)組；E：HPS；a：P<0.01

圖2結(jié)腸組織病理變化與HPS(HE×40)

a：P<0.05,b：P<0.01

圖3結(jié)腸上皮組織炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

a：P<0.05,b：P<0.01

圖4結(jié)腸上皮組織ERS相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中新生多肽折疊與組裝、蛋白質(zhì)修飾與加工的重要場所，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。研究表明，患有IBD的人類與動物的腸道上皮細(xì)胞中存在ERS，ERS激活的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)對于維持腸道上皮細(xì)胞的正常形態(tài)與功能均很重要，但過度ERS會導(dǎo)致細(xì)胞啟動凋亡程序[2-3,8]。冬凌草甲素具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]，近年亦有研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對肝癌HepG2細(xì)胞中ERS具有調(diào)節(jié)作用[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素干預(yù)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠可使其結(jié)腸炎DAI評分和病理指標(biāo)等明顯緩解，其療效與臨床上應(yīng)用于UC的柳氮磺胺吡啶相當(dāng)，且結(jié)腸上皮組織中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6和COX-2 mRNA表達(dá)亦明顯降低，提示冬凌草甲素可能通過其抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用對UC結(jié)腸具有保護(hù)作用。

GRP78能通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊或未折疊蛋白結(jié)合的方式來恢復(fù)異常蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要分子伴侶對細(xì)胞起保護(hù)作用[10]。在應(yīng)激發(fā)生時(shí)GRP78表達(dá)顯著增高，其表達(dá)水平在一定程度上反映細(xì)胞ERS的水平，可作為ERS的標(biāo)志蛋白[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸上皮組織中GRP78 mRNA表達(dá)水平較健康組有明顯上調(diào)，表明DSS誘導(dǎo)UC小鼠的結(jié)腸上皮組織中伴隨ERS發(fā)生，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在使用冬凌草甲素或柳氮磺胺吡啶干預(yù)時(shí)GRP78 mRNA表達(dá)水平明顯下降，并與健康組相當(dāng)，一定程度上說明結(jié)腸上皮組織中ERS恢復(fù)到正常水平，提示冬凌草甲素能抑制UC小鼠ERS的作用。

IER1α、PERK和ATF6是哺乳動物的3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，正常生理?xiàng)l件下與GRP78穩(wěn)定結(jié)合，ERS發(fā)生時(shí)則與GRP78解離，引發(fā)UPR，發(fā)揮ERS狀態(tài)下的保護(hù)細(xì)胞功能，但這3種蛋白質(zhì)也會介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-3]。本研究中，模型組小鼠結(jié)腸上皮組織細(xì)胞中IRE1α、PERK及ATF6 mRNA的表達(dá)水平較健康組明顯上升，表明DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸上皮組織發(fā)生UPR；冬凌草甲素可以抑制其中PERK和ATF6 mRNA的表達(dá)升高，但對IRE1α mRNA卻沒有明顯影響，而柳氮磺胺吡啶對這3種ERS相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)均有明顯下調(diào)作用。這一結(jié)果提示，盡管本研究中冬凌草甲素與柳氮磺胺吡啶防治UC療效相當(dāng)，但從ERS角度來說二者的作用機(jī)制存在一定差異，而且目前關(guān)于柳氮磺胺吡啶在ERS方面的作用少有報(bào)道。冬凌草甲素干預(yù)未能降低IRE1α mRNA高表達(dá)，提示可能存在其他機(jī)制抑制了高水平IRE1α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。有研究報(bào)道，IRE1α缺失會出現(xiàn)CHOP表達(dá)增加，因此IRE1α高表達(dá)亦可能抑制CHOP表達(dá)，二者之間的平衡保護(hù)細(xì)胞適度ERS[12]。

ERS雖然可以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，但過強(qiáng)或過久ERS則會啟動細(xì)胞凋亡程序，CHOP則是其中的一條凋亡通道[13]，CHOP基因敲除小鼠在由三硝基苯磺酸誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎過程中細(xì)胞凋亡減弱[14]。本研究中，DSS誘導(dǎo)的UC模型組小鼠結(jié)腸上皮組織中CHOP mRNA的表達(dá)水平較健康組明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致；使用冬凌草甲素干預(yù)則顯著降低增高的CHOP mRNA，表明冬凌草甲素將UC小鼠結(jié)腸上皮組織中ERS限制在適當(dāng)程度內(nèi)從而利于其發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞作用。

綜上所述，冬凌草甲素可以抑制小鼠結(jié)腸上皮組織中炎癥相關(guān)因子表達(dá)，調(diào)控ERS，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定，這可能是冬凌草甲素防治UC的作用機(jī)制之一。目前國內(nèi)外對冬凌草甲素在ERS方面作用的報(bào)道較少，因此仍需在動物水平和細(xì)胞水平上對其詳細(xì)作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

[1]安阿玥．肛腸病學(xué)[M]．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：341．

[2]CHONG W C,SHASTRI M D,ERI R.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress:a vicious nexus implicated in bowel disease pathophysiology[J].Int J Mol Sci,2017,18(4):771-789.

[3]HOSOMI S,KASER A,BLUMBERG R S.Role of endoplasmic reticulum stress and autophagy as interlinking pathways in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].Curr Opin Gastroenterol,2015,31(1):81-88.

[4]郭萍，李玉山，郭遠(yuǎn)強(qiáng)．冬凌草化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J]．藥物評價(jià)研究，2010，33(2)：144-147．

[5]臧凱宏，杜麗東，劉曉梅，等．冬凌草甲素片對醋酸誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用(英文)[J]．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(9)：781-785．

[6]鄶一賀，王麗京，鄧慧君，等．靶向抑制巨噬細(xì)胞Act1表達(dá)對潰瘍性結(jié)腸炎的作用[J]．中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2016，24(6)：585-590．

[7]MURANO M,MAEMURA K,HIRATA I,et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate Sodium(DSS)-induced colitis[J].Clin Exp Immunol,2000,120(1):51-58.

[8]TRéTON X,PéDRUZZI E,CAZALS-HATEM D,et al.Altered endoplasmic reticulum stress affects translation in inactive colon tissue from patients with ulcerative colitis[J].Gastroenterology,2011,141(3):1024-1035.

[9]王輝，葉燕，禹志領(lǐng)．冬凌草甲素對HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白IRE-1、PERK和CHOP的作用研究[J]．中藥新藥與臨床藥理，2012，23(3)：263-266．

[10]QIAN Y,TIFFANY-CASTIGLIONI E.Lead-induced endoplasmic reticulum(ER)stress responses in the nervous system[J].Neurochem Res,2003,28(1):153-162.

[11]RUTKOWSKI D T,KAUFMAN R J.That which does not kill me makes me stronger:adapting to ER stress[J].Trends Biochem Sci,2007,32(10):469-476.

[12]ZHANG H S,CHEN Y,FAN L,et al.The endoplasmic reticulum stress sensor IRE1(in intestinal epithelial cells is essential for protecting against colitis[J].J Biol Chem,2015,290(24):15327-15336.

[13]KASER A,ADOLPH T E,BLUMBERG R S.The unfold protein response and gastrointestinal disease[J].Semin Immunopathol,2013,35(3):307-319.

[14]NAMBA T,TANAKA K I,ITO Y,et al.Positive role of CCAAT/Enhancer-Binding protein homologous protein,a transcription factor involved in the endoplasmic reticulum stress response in the development of colitis[J].American Journal of Pathology,2009,174(5):1786-1798.

[15]CHOI Y,KOH S J,LEE H S,et al.Roxithromycin inhibits nuclear factor kappaB signaling and endoplasmic reticulum stress in intestinal epithelial cells and ameliorates experimental colitis in mice[J].Exp Biol Med,2015,240(12):1664-1671.