趙 昕,張 鵬，黃 娜，王東風(fēng)，陳明明*，許志偉

0 引言

烏及丸是解放軍第205醫(yī)院配制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由白芍、白及、高良姜、甘草、延胡索、海螵蛸、香附等藥味組成，有溫中散寒、行氣止痛、制酸止血的功效，用于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、胃酸過多等癥，在臨床上療效滿意。為保證臨床用藥有效、安全，對本研究烏及丸進(jìn)行了質(zhì)量控制研究，制定了烏及丸的檢驗(yàn)方法,制訂后的定性定量方法可控制烏及丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀： LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津)；KQ3200E型昆山超聲波處理器。電子分析天平(120D型，北京島津公司)；對照藥材(中檢院，延胡索： 110726-201414；高良姜：121263-201304)；對照品(中檢院，甘草次酸：110723-201413；芍藥苷：供含量測定用，110736-201438)；烏及丸(由解放軍第205醫(yī)院提供，批號：20141120、20141204、20141218)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙腈(色譜純，Sigma公司)，磷酸(分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，重蒸水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 海螵蛸 顯微鏡下可見透明碎片呈不規(guī)則形狀且其上有網(wǎng)狀或點(diǎn)狀紋理。見圖1。

圖1 不規(guī)則透明碎片(海螵蛸)

2.1.2 高良姜 置顯微鏡下淀粉粒棒槌形、腎形或菱角形，有的中部突出作分枝狀，長約至50 μm，稀有更長的，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、短縫狀或不明顯。見圖2。

圖2 淀粉粒(高良姜)

2.1.3 白及 置顯微鏡下觀察：表皮細(xì)胞觀垂周壁波狀彎曲，略增厚。見圖3。

圖3 表皮細(xì)胞(白及)

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 延胡索[1]取烏及丸1丸，剪碎，加硅藻土適量研磨成粉末，加濃氨試液適量使?jié)櫇瘢佣燃淄?0 ml加熱回流1 h，放至室溫，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液；另取延胡索對照藥材粉末約2 g，按供試品溶液制備方法操作，制得對照藥材溶液。按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺延胡索陰性樣品，取1丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺延胡索陰性樣品溶液。照薄層色譜法[2]，取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，置層析缸中，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(10∶1∶1.5∶2)，展開，取出，晾干，在紫外光燈(365 nm)下檢視，在烏及丸供試品色譜與延胡索對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(圖4)。此外，3批樣品熒光斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖5)。

2.2.2 高良姜[3]取烏及丸2丸，剪碎，加硅藻土8 g研粉，加二氯甲烷50 ml超聲30 min，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml 使溶解，作為供試品溶液；另取高良姜對照藥材研粉末5 g，按供試品溶液制備方法操作，制得對照藥材溶液；按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺高良姜陰性樣品，取2丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺高良姜陰性樣品溶液。照薄層色譜法[2]取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，置層析缸中，展開劑為石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)，展開，取出，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色，放于干燥箱內(nèi)105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。烏及丸供試品與高良姜對照藥材色譜相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無此斑點(diǎn)(圖6)。此外，3批樣品斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖7)。

圖4 延胡索薄層色譜鑒別(專屬性)

圖5 延胡索薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

圖6 高良姜薄層色譜鑒別(專屬性)

圖7 高良姜薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.2.3 甘草[1，4]取烏及丸1丸，剪碎，加4 g硅藻土研磨成粉末，加鹽酸10 ml及二氯甲烷50 ml加熱回流1 h，放至室溫，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液；精密稱取甘草次酸對照品20 mg于10 ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，作為甘草次酸對照品溶液；按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺甘草陰性樣品，取1丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺甘草陰性樣品溶液。參照薄層色譜法[2]，制得烏及丸缺甘草的陰性樣品溶液。參照薄層色譜法[2]，取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，置層析缸中，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(3∶1∶0.2)，展開，取出，晾干，在紫外光燈(254 nm)下檢視，烏及丸供試品色譜與甘草次酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同深藍(lán)色的斑點(diǎn)，陰性對照無此斑點(diǎn)(圖8)。此外，3批樣品此斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖9)。

圖8 甘草薄層色譜鑒別 (專屬性)

2.3 烏及丸中芍藥苷含量測定[1，5-6]

2.3.1 溶液的制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品(已置五氧化二磷減壓干燥器中12 h)20 mg于500 ml容量瓶中，加入適量稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。②烏及丸樣品溶液的制備：取烏及丸1.5 g，剪碎，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，放于已精密加入50 ml稀乙醇的三角瓶中，密塞后稱重，超聲30 min，放至室溫，稱重并補(bǔ)充稀乙醇至超聲前重量，過濾，取續(xù)濾液，作為烏及丸樣品溶液。③陰性樣品溶液的制備：取除白芍外的其他藥材，按烏及丸處方比例及制劑工藝制成丸劑，按照“2.3.2”項(xiàng)方法制成陰性樣品溶液。

圖9 甘草薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.3.2 色譜條件與專屬性 VP-ODS (5 μm,4.6 mm×150 mm) 色譜柱；乙腈-0.1%磷酸(15∶85)為流動相；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min；在230 nm波長下檢測；各種溶液分別進(jìn)樣10 μl；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于2 000。分別取上述3種溶液進(jìn)樣，結(jié)果表明，樣品中待測成分分離良好，陰性對照無干擾，見圖10。

2.3.3 芍藥苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線 在100 ml容量瓶中精密稱取芍藥苷對照品(已置五氧化二磷減壓干燥器中12 h)25 mg，加入稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，配制成250 μg/ml芍藥苷對照品溶液，分別精密取此芍藥苷對照品溶液0.5、1、2、4、8、16 ml于50 ml容量瓶中，加入稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，配制成2.5、5、10、20、40、80 μg/ml的溶液，注入液相色譜儀各10 μl，按“2.3.2”項(xiàng)方法測定各自峰面積，以對照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程Y=5 456.1X-4 956.7，r=0.999 4。結(jié)果可見測得峰面積與芍藥苷對照品在2.5～80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度 精密吸取芍藥苷對照品溶液10 μl，按“2.3.2”項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積值的RSD為0.45% (n=6)，符合要求。

2.3.5 穩(wěn)定性 取同一批烏及丸樣品約1.5 g，剪碎，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，按照“2.3.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液，取續(xù)濾液按“2.3.2”項(xiàng)分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測得芍藥苷對照品峰面積值的RSD為1.81% (n=5)，表明其在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性 取同一批烏及丸約1.5 g(共6份)，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，按照“2.3.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液，取續(xù)濾液按“2.3.2”項(xiàng)方法測定。結(jié)果樣品中芍藥苷平均含量為0.77 mg/g，RSD為1.68% (n=6)，符合要求。

2.3.7 加樣回收率 分別精密稱定同一批共6份烏及丸(每份約0.7 g)，分別剪碎后，加入芍藥苷對照品溶液(560 μg/ml)各1 ml，稱定重量后加硅藻土適量，研磨成粉末，放于已精密加入50 ml稀乙醇的三角瓶中，密塞后稱重，超聲30 min，放至室溫，稱重并補(bǔ)足重量，取其續(xù)濾液，按“2.3.2”項(xiàng)方法測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果符合要求。見表1。

2.3.8 樣品測定 取3個(gè)不同批號(批號：20141120、20141204、20141218)的烏及丸樣品，按“2.3.1”項(xiàng)操作，按“2.3.2”測定其中芍藥苷的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 《中國藥典》及文獻(xiàn)中延胡索的薄層色譜鑒別多采用較大比例的甲醇作為提取溶劑，因其對實(shí)驗(yàn)操作人員危害較大，故在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)多次試驗(yàn)將其替換為毒性較小的二氯甲烷作為提取溶劑，達(dá)到同樣提取效果的同時(shí)降低了對實(shí)驗(yàn)操作人員健康的損害。

3.2 烏及丸中芍藥苷含量測定中，制備樣品溶液時(shí)，為了保證回收率，本實(shí)驗(yàn)分別對提取方式、提取溶劑、溶劑用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)進(jìn)行考察。其中考察提取方式時(shí)，分別采用浸泡、超聲提取與加熱回流的方式，結(jié)果表明，采用超聲和加熱提取方法時(shí)，二者所測得的芍藥苷含量較高且含量相當(dāng)，故將提取方法定為操作更為簡便、重現(xiàn)性更好的超聲提??；考察提取溶劑時(shí)，分別使用了30%乙醇、稀乙醇、甲醇、30%甲醇等溶劑，結(jié)果表明，提取溶劑為稀乙醇及甲醇時(shí)所測得的芍藥苷含量近似且高于其他溶劑，故采用稀乙醇為提取溶劑，結(jié)果滿意。

圖10 芍藥苷高效液相色譜圖

編號烏及丸樣品量(g)烏及丸中芍藥苷量(mg)芍藥苷對照品加入量(mg)芍藥苷測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.701 20.540.561.0999.0920.701 60.540.561.11100.930.701 50.540.561.11100.9100.80.8940.708 10.540.561.11100.950.710 90.550.561.12101.860.708 60.540.561.11100.9

表2 烏及丸含量測定結(jié)果

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