高玉雪 曹珍 呂世軍 朱學(xué)濤 李峰 王茹燕 徐金媛 鐘瑾怡 史立宏

(濰坊醫(yī)學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性死亡的常見惡性腫瘤[1-2]。盡管綜合檢查和各種治療方法應(yīng)用于乳腺癌患者，在侵襲與轉(zhuǎn)移方面臨床效果仍不理想[3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)不僅參與胚胎生長[4]，而且與惡性腫瘤的侵襲與遷移密切相關(guān)[5]。遠(yuǎn)華蟾毒精是傳統(tǒng)中藥，具有免疫調(diào)節(jié)、強(qiáng)心和抗腫瘤的作用[6-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)華蟾毒精可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，本研究進(jìn)一步觀察遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購自美國ATCC公司，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維鏈接蛋百(Fibronectin)抗體購自英國Abcam公司，snail, Akt, P-Akt, m-TOR and P-mTOR購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4T1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞長至75%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 收集處于對(duì)數(shù)期4T1細(xì)胞，制成4×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液， 100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組每孔加175μl濃度分別為0.05、0.1、0.5、1和1.25μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精，對(duì)照組不加藥；空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜，置于搖床上低速震蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)期4T1細(xì)胞，5×105個(gè)/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。用滅菌的10μl槍頭均勻劃痕，PBS洗3次。設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液含遠(yuǎn)華蟾毒精濃度分別0.05和0.5μg/ml，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別0和24h后用顯微鏡( ×40) 觀察并拍照，比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的遷移程度，測(cè)量遷移距離，并計(jì)算遷移率。

1.2.4 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠融化后用預(yù)冷的無血清1640按1：19稀釋，每個(gè)小室加入50μl稀釋后的Matrigel，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1h。以5×105/ml的密度將細(xì)胞重懸于無血清的1640培養(yǎng)液中，上室接種200μl細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為0.05和0.5μg/ml，對(duì)照組不加藥；下室加入600μl含10%胎牛血清的1640，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h。吸出上室液體，PBS洗滌3次，棉簽擦凈濾膜上室面細(xì)胞，將遷移到膜下室面細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，1%結(jié)晶紫染色10min。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，除小室內(nèi)不鋪Matrigel，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5 免疫熒光 取出24孔板，放入已滅菌的爬片，收集處于對(duì)數(shù)期4T1細(xì)胞，2×104個(gè)/孔接種于爬片上，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為0.5μg/ml，對(duì)照組不加藥，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h。4%多聚甲醛固定爬片30min；0.5%TritonX-100室溫通透20min；山羊血清室溫封閉1h。滴加相應(yīng)一抗60μl，放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜。避光滴加熒光二抗，在濕盒中37℃孵育1h。復(fù)染核，避光滴加DAPI，在濕盒中室溫孵育10min。吸干爬片上的液體，用熒光防淬滅劑將爬片粘到載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 收集對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)遠(yuǎn)華蟾毒精處理的4T1細(xì)胞，加入預(yù)冷裂解液，冰上裂解后，4℃12000rpm離心5min，BCA法測(cè)濃度，蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，100℃沸水中煮5min，置于-20℃保存。然后在SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉37℃封閉1h后， 孵育相應(yīng)一抗4℃過夜。TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗，室溫孵育1h。TBST洗膜3次，10min/次，ECL化學(xué)顯色。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞增殖影響 MTT試驗(yàn)結(jié)果，抑制率= [(對(duì)照組平均OD值一實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值一空白對(duì)照組平均OD值)]×100%，觀察組不同濃度(0.05、0.1、0.5和1μg/ml)遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為(5.4±3.4)%、( 8.0±3.5)%、(10.2±3.5)% 和(13.0±6.8)%，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃度分別為1.25和1.5μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別( 38.8±8.8)%和(64.3±14.0)%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低濃度遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞增殖影響不明顯，因此采用0.05和0.5μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞遷移影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，24h后，對(duì)照組、0.05和0.5μg/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕遷移率分別為(85.8±5.2)%、(49.3±4.5)%和(30.3±4.5)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。遠(yuǎn)華蟾毒精抑制4T1細(xì)胞遷移，且呈濃度依賴性。

2.3 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，24h后，對(duì)照組、0.05和0.5μg/ml實(shí)驗(yàn)組穿至下室的細(xì)胞數(shù)分別為(181.7±16.7)、(88.0±11.6)和(32.7±5.2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，24h后，對(duì)照組、0.05和0.5μg/ml實(shí)驗(yàn)組穿至下室的細(xì)胞數(shù)分別為(142.2±14.9)、(55.2±9.3)和(27.5±7.1)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)表明，遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞遷移與遷移具有抑制作用，且呈濃度依賴性。

2.4 遠(yuǎn)華蟾毒精抑制4T1細(xì)胞EMT標(biāo)志物及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，24h后，0.5μg/ml遠(yuǎn)華蟾毒精與對(duì)照組相比，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Fibronectin表達(dá)減弱，見圖1。

圖1 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響 Figure 1 The effects of telocinobufagin on EMT related markers注：紅色代表E-鈣粘蛋白；綠色代表波形蛋白和纖維連接蛋白

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果，E-鈣粘蛋白在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.65±0.27)、(2.65±0.30)、(3.55±0.36)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)；波形蛋白在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.81±0.18)、(1.20±0.13)、(0.56±0.07)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；纖維鏈接蛋白在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(6.96±1.75)、(3.78±0.87)、(1.52±0.69)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)錄因子Snail在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.67±0.12)、(0.34±0.07)、(0.21±0.04)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；間質(zhì)質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白和纖維連接蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)減弱。P-AKT在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.15±0.07)、(0.56±0.06)、(0.32±0.03)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p-mTOR在對(duì)照組(0μg/ml)與實(shí)驗(yàn)組(0.05和0.5μg/ml)的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.27±0.09)、(0.65±0.10)、(0.27±0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，磷酸化Akt和mTOR表達(dá)減弱。

3 討論

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤， 也是引起婦女死亡的主要原因, 且發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)[9]。然而，大多數(shù)患者的主要致死因素不是原發(fā)腫瘤，而是乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞在特定生理與病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)變成為具有遷移能力的間質(zhì)表型細(xì)胞的過程。EMT不僅參與人體正常的生物學(xué)過程，如胚胎的發(fā)生和發(fā)育、組織重建以及纖維化，而且與腫瘤轉(zhuǎn)移過程有密切關(guān)系[10,11]。EMT在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起最重要的作用，同時(shí)也參與了轉(zhuǎn)移、侵襲過程，并影響患者對(duì)治療的反應(yīng)性，也可降低患者生存率[12]。E-cadherin、Vimentin和Fibronectin是EMT典型的標(biāo)志物[13-14]。轉(zhuǎn)錄因子Snail與EMT相關(guān)，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[15-16]。當(dāng)腫瘤發(fā)生EMT時(shí)， 細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附能力降低，E-cadherin表達(dá)下降，Vimentin和Fibronectin表達(dá)增強(qiáng)，腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力增加[17-18]。

PI3K-Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤EMT的發(fā)生，參與侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程[19]。PI3K/AKT信號(hào)可上調(diào)細(xì)胞內(nèi) Snail轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，下調(diào)E鈣黏蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生EMT[20]。

近年來，中藥單體對(duì)腫瘤的治療效果越來越顯著，關(guān)注程度逐漸增加。遠(yuǎn)華蟾毒精是從蟾酥中提取的單體化合物，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。為了研究遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT的影響，該實(shí)驗(yàn)選擇具有高侵襲能力的鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，進(jìn)一步揭示遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的體外抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞增殖有抑制作用，但效果不明顯；高濃度遠(yuǎn)華蟾毒精能明顯抑制4T1細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，遠(yuǎn)華蟾毒精抑制4T1細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移；且抑制作用具有濃度依賴性。免疫熒光與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果共同揭示，與對(duì)照組相比，遠(yuǎn)華蟾毒精上調(diào)上皮表型E-cadherin，下調(diào)間質(zhì)表型Vimentin和Fibronectin。遠(yuǎn)華蟾毒精也抑制了轉(zhuǎn)錄因子Snail、p-Akt和p-mTOR的表達(dá)。從分子水平說明遠(yuǎn)華蟾毒精抑制4T1細(xì)胞EMT，通過Akt/mTOR信號(hào)通路，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail，進(jìn)而降低下游靶蛋白Vimentin和Fibronectin的表達(dá)以及增加E-cadherin的表達(dá)，抑制4T1細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移能力，從而達(dá)到抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。

4 結(jié)論

遠(yuǎn)華蟾毒精通過Akt/mTOR/Snail信號(hào)通路抑制乳腺癌的遷移、侵襲及EMT，為遠(yuǎn)華蟾毒精的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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