羅彬予 張琴 張朝軍 田云鴻 任明揚(yáng)

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院胃腸外科， 四川 南充 637000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 貴州 遵義563000； 3.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院普通外科， 北京100048)

腸缺血再灌注損傷是腸缺血再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、心肺功能不全、器官移植等過(guò)程中常見(jiàn)組織器官損傷之一[1]。在I/R下使腸粘膜細(xì)胞受到損傷，進(jìn)一步使屏障功能減弱。IELs作為一群主要由T淋巴細(xì)胞組成的特殊細(xì)胞群構(gòu)建的腸免疫屏障[2]。白細(xì)胞介素-7(IL-7)細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育起重要作用[3]。前期實(shí)驗(yàn)在腸粘膜屏障中我們發(fā)現(xiàn)在I/R下腸上皮細(xì)胞來(lái)源(Intestinal epith- etlial cells IECs)的骨形成蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4 BMP-4)分泌表達(dá)增加，通過(guò)與IELs上的BMP受體結(jié)合后，激活Smad信號(hào)通路促進(jìn)IELs的凋亡[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞來(lái)源的IL-7能夠促進(jìn)胸腺前體CD34+細(xì)胞增殖、發(fā)育，BMP-4和IL-7相互作用共同調(diào)節(jié)維持胸腺前體CD34+細(xì)胞的數(shù)量和功能，避免過(guò)度增殖和凋亡。在小腸中IL-7主要來(lái)源于IECs，對(duì)IELs的數(shù)量、功能維持其重要作用，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[6-7]在TPN、IBD、I/R刺激下IELs的數(shù)量減少、功能減弱，腸道免疫功能受損，腸屏障功能減弱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠腸缺血再灌注模型和給予BMP4蛋白刺激IELs，觀察IELs的保護(hù)因子IL-7/IL-7R信號(hào)通路的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 選取6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠32只，體質(zhì)量20～30g，由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分組為：①腸缺血再灌注組(I/R組)：共16只，麻醉后，從腹正中線進(jìn)腹，整理小腸，找到并分離腸系膜動(dòng)脈根部后,用無(wú)創(chuàng)傷血管夾夾閉腸系膜動(dòng)脈,25 min后松夾，縫合并關(guān)閉腹腔。造模成功后在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠。②假手術(shù)組(Sham組)：共16只，模型建立時(shí)只進(jìn)行分離，不夾閉腸系膜上動(dòng)脈，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠。每組各取8只用于免疫熒光檢測(cè)腸上皮IL-7表達(dá)，8只用于IELs分離提取，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD127及STAT5蛋白磷酸化變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 重組人BMP4、NOGGIN蛋白(美國(guó)PeproTech公司)；IL-7、P-STAT5、CD127、CD45、GAPDH抗體、山羊抗兔二抗(美國(guó)BD公司)；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物試劑公司) Percoll液、細(xì)胞裂解液(上海前塵生物科技有有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);牛血清粉BSA、胰蛋白酶(sigma公司)；IEL細(xì)胞分離液、流式緩沖液、Western blot主要試劑(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)IECs內(nèi)IL-7蛋白表達(dá) 在I/R刺激下空腸最為敏感，取部分空腸(距屈式韌帶15cm)于預(yù)冷的生理鹽水中輕洗、去除殘留腸內(nèi)容物。切取部分組織塊(大小：1.0×0.5 cm)，4%多聚甲醛中固定24h，石蠟包埋。組織石蠟切片二甲苯脫蠟和系列乙醇濃度梯度水化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗；0.3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min；10%山羊血清封閉，室溫封閉10min；一抗IL-7(1:100)，4℃過(guò)夜；二抗生物素標(biāo)記的IgG(1:200)，室溫60min；PBS洗3次，加DAPI工作液，室溫5 min；用熒光共聚焦顯微鏡觀察腸上皮IL-7蛋白表達(dá)。

1.2.2 IEL細(xì)胞提取及培養(yǎng) 小腸取出放置在組織培養(yǎng)液(RPMI 1640，10%胎牛血清)。切成厚5mm切片，在60ml IELs分離液搖晃洗滌(37℃ 25 min)，玻璃棉過(guò)濾組織碎渣，離心(4℃ 1500rpm/min 5min)。加15ml 40%等滲percoll液離心(4℃ 2200rpm/min 22 min),加20mlRPMI 1640組織培養(yǎng)基重懸離心。分離的IEL細(xì)胞數(shù)量純度≥95%。將收集的細(xì)胞結(jié)種至六孔板內(nèi)，加入RPMI-1640胎牛血清的全培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入30ng/ml BMP4、30ng/ml BMP4+NOGGIN、2ng/ml IL-7蛋白刺激6小時(shí)后，收集細(xì)胞。

1.2.3 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠小腸上皮細(xì)胞株IEC-6(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所提供)，加全培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)基+5%胎牛血清+胰島素+青-鏈霉素雙抗)在20% O2，5% CO2，75% N2，37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)無(wú)菌培養(yǎng)、傳代。待IEC-6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀況良好，接種至六孔板內(nèi)。分別標(biāo)記A、B、C3組，A組作為空白對(duì)照組、B組內(nèi)加入30ng/ml BMP4蛋白、C組加入30ng/ml BMP4+ NOGGIN蛋白培養(yǎng)6小時(shí)后，收集細(xì)胞。

1.2.4 Western blot檢測(cè)IL-7蛋白 收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按照BCA法測(cè)定蛋白濃度，配制12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，加入一抗IL-7(1:100)、GAPDH(1:1000)4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜后加入山羊抗兔二抗(1:1000)，搖床2小時(shí)，洗膜后加入Supersignal發(fā)光液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 將收集的細(xì)胞，在冰上PBS洗滌3次，離心沉淀細(xì)胞，加流式細(xì)胞緩沖液300ul，CD45-APC抗體(1:150)標(biāo)記IEL細(xì)胞表型， CD127-FITC抗體(1:200)、P-STAT5-FITC抗體(1：100),4℃避光孵育45min，離心沉淀，PBS洗滌一次，加300ul流式緩沖液。上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 在I/R下腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá)下調(diào) 建立小鼠腸缺血再灌注損傷模型，在腸I/R損傷6小時(shí)后取部分空腸組織固定、染色后，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá)變化，結(jié)果可見(jiàn)小鼠在I/R處理后，腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá)較Sham組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 小腸絨毛上皮細(xì)胞中IL-7蛋白(綠色)表達(dá)(免疫熒光染色FITC-綠色/PE-紅色 ×1000) Figure 1 IL-7 protein (green) expression in small intestinal villus epithelium (immunofluorescence staining, FITC- green /PE-red x 1000)注：A.Sham組腸上皮細(xì)胞中IL-7蛋白表達(dá)明顯；B.I/R組腸上皮細(xì)胞中IL-7蛋白表達(dá)明顯減少

2.2 在I/R下腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-7R信號(hào)下調(diào) 在小鼠I/R損傷6小時(shí)后，取全段小腸，分離提取IELs后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IELs中CD127、P-STAT5蛋白表達(dá)變化，結(jié)果IELs中CD127蛋白表達(dá)與Sham組比較減少(12.87±3.58)%,P-STAT5蛋白表達(dá)與Sham組比較減少(6.48±2.06)%, I/R組與Sham組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 BMP4下調(diào)腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá) 在I/R下IL-7/IL-7R信號(hào)通路下調(diào)，使IELs的保護(hù)功能減弱，腸道免疫功能受損[8]，B組給予外源性BMP-4蛋白刺激IEC-6細(xì)胞6小時(shí)后，Westen Blot檢測(cè)在腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá)變化，結(jié)果腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白表達(dá)減少，C組給予BMP特異性拮抗劑NOGGIN刺激后可逆轉(zhuǎn)BMP對(duì)IL-7的抑制作用，見(jiàn)圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在I/R條件下IELs中CD127、P-STAT5表達(dá)變化 Figure 2 Flow cytometry used to detect the changes of CD127 and P-STAT5 expression in IELs under I/R注：CD127-白細(xì)胞介素-7受體，P-STAT5-磷酸化-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子5；與Sham組比較,①P<0.05

圖3 Western blot技術(shù)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞內(nèi)IL-7蛋白在BMP4蛋白刺激下表達(dá)變化 Figure 3 Western blot detects the change of IL-7 protein in intestinal epithelial cells under the stimulation of BMP4 protein注：與A組比較，①P<0.05；與A組比較，②P>0.05

2.4 BMP-4下調(diào)腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-7R信號(hào)下調(diào) 分離培養(yǎng)IELs，分別標(biāo)記A、B、C三組，A組作為空白對(duì)照組，B組給予外源性BMP-4蛋白刺激IEL細(xì)胞6小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD127、P-STAT5蛋白表達(dá)變化。與A組比較，給予BMP-4蛋白刺激下CD127表達(dá)明顯減少(7.75±1.09)%，同時(shí)P-STAT5 蛋白在BMP-4刺激下表達(dá)下調(diào)(4.37±0.92)%，B組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而C組給予拮抗劑NOGGIN和A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IELs中CD127、P-STAT5蛋白在BMP4刺激下表達(dá)變化 Figure 4 Flow cytometry to detect the changes of CD127 and P-STAT5 proteins in IELs under BMP4 stimulation注：A.空白對(duì)照組；B.BMP4；C.BMP4+NOGGIN；與A組比較，①P<0.05；與A組比較，②P>0.05

2.5 BMP-4通過(guò)下調(diào)IL-7促進(jìn)IELs凋亡 分離單獨(dú)培養(yǎng)IELs細(xì)胞，分別標(biāo)記A、B、C、D組，A組為空白對(duì)照組，B組給予外源性BMP4蛋白刺激培養(yǎng)6小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B組與A組比較，IELs細(xì)胞凋亡率增加(11.8±5.43)%；C組給予外源性IL-7蛋白刺激后，IELs的凋亡率降低(11.1±4.28)%。B組、C組與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而D組給予BMP-4與IL-7蛋白聯(lián)合刺激后與A組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IELs中各組凋亡變化 Figure 5 Flow cytometry to detect apoptosis in each group of IELs注：A.空白對(duì)照組；B.BMP4；C.IL-7；D.BMP4+IL-7

3 討論

腸黏膜屏障是一個(gè)復(fù)雜的屏障結(jié)構(gòu)，主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學(xué)屏障等不同組分組成。其中由腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC)和腸上皮間淋巴細(xì)胞(intestianl intr aepithelial lymphocytes,IEL)為主組成的機(jī)械屏障和免疫屏障是決定腸屏障功能的核心因素[9]。在腸黏膜細(xì)胞中，IECs與IELs位置相互鄰近，IECs可分泌細(xì)胞因子直接或間接的作用于IELs，影響IELs的增殖、分化、凋亡[10-11]。在腸I/R損傷條件下，IELs的功能減弱、數(shù)量減少、凋亡增加[12]。在小腸胃腸外營(yíng)養(yǎng)(TPN)、DSS誘導(dǎo)下的結(jié)腸炎條件下發(fā)現(xiàn)在IECs內(nèi)IL-7蛋白分泌表達(dá)減少，同時(shí)IELs上CD127表達(dá)也減弱，使IELs的數(shù)量與功能失衡，使腸道免疫屏障功能受損[7, 13-16]。

腸I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜、多因素的損傷機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在I/R下腸黏膜絨毛斷裂、固有層細(xì)胞脫落，IEL細(xì)胞數(shù)量減少、功能減弱[4, 17]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立小鼠腸缺血再灌注(I/R)模型，通過(guò)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在IECs中IL-7蛋白表達(dá)減少，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IELs中IL-7受體CD127和下游信號(hào)通路蛋白STAT5磷酸化水平也下調(diào)。因此證實(shí)小腸在I/R刺激下，IL-7/IL-7R信號(hào)通路被抑制，使IELs的保護(hù)功能被減弱，加速了IELs的凋亡，在I/R下IL-7/IL-7R信號(hào)下調(diào)的機(jī)制目前還不是很清楚。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在I/R下腸上皮細(xì)胞中BMP-4分泌表達(dá)增加，與IELs上的BMP受體結(jié)合后，激活Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子TNF-a、IL-6的釋放，促進(jìn)IELs的凋亡率增加[4, 18]。在胸腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BMP-4可通過(guò)下調(diào)CD127和STAT5蛋白磷酸化水平，來(lái)維持胸腺前體CD34+細(xì)胞的數(shù)量、功能的穩(wěn)定性[5, 19]。我們假設(shè)在腸I/R損傷條件下腸黏膜細(xì)胞中IL-7/IL-7R信號(hào)通路的抑制與BMP的信號(hào)通路激活有關(guān)。通過(guò)外源性BMP4蛋白刺激IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)后，Western blot發(fā)現(xiàn)BMP-4抑制IL-7蛋白在IECs中的表達(dá)。在I/R下，IECs來(lái)源的BMP-4分泌表達(dá)增加，也會(huì)對(duì)鄰近的IELs中IL-7R信號(hào)通路影響，單獨(dú)分離培養(yǎng)IELs，給予BMP-4刺激6小時(shí)后，流式技術(shù)發(fā)現(xiàn)CD127、P-STAT5蛋白表達(dá)減少。給予BMP特異性拮抗劑NOGGIN聯(lián)合刺激后IL-7/IL-7R信號(hào)無(wú)明顯變化。我們結(jié)合前期研究，腸IECs來(lái)源的BMP4蛋白對(duì)IELs中IL-7/IL-7R信號(hào)通路下調(diào)，進(jìn)一步加重腸黏膜屏障損傷。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腸I/R下，IECs來(lái)源的BMP-4分泌表達(dá)增加，BMP-4抑制腸黏膜細(xì)胞中的IL-7/IL-7R信號(hào)通路，進(jìn)一步使IELs的保護(hù)作用減弱，疊加BMP-4通過(guò)Smad、NF-kB的激活誘導(dǎo)TNF-a、IL-6等炎癥因子的釋放，促進(jìn)IELs的數(shù)量減少、功能減弱，加重腸黏膜屏障功能的減弱[20]。為進(jìn)一步探討IECs-IELs的對(duì)話機(jī)制為研究預(yù)防腸黏膜屏障損害提供理論依據(jù)。

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