肖 婷， 聶麥茜， 聶紅云， 朱洪勝， 喬 琪， 陳 軍

(西安建筑科技大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055)

隨著石油及其產(chǎn)品的開發(fā)利用，烴類污染問題已經(jīng)嚴重影響人類生存環(huán)境，致使人類不得不尋求一種經(jīng)濟有效的治理方法。生物降解法因具有低成本、高效、無二次污染等優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注[1-2]。能降解烴類污染物的微生物種類繁多[3-4]，其中銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為降解石油烴的優(yōu)勢菌有以下優(yōu)點[5-9]：①在自然界中分布廣泛，且易于從環(huán)境中分離；②適應(yīng)能力強，能以多種烴為碳源和能源進行代謝且有豐富的胞外分泌物；③有代謝烷烴的優(yōu)勢基因，因此具有較好的應(yīng)用前景。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小分子有機酸廣泛存在于自然界及其各類污染物代謝體系中。好氧微生物降解烴過程中所產(chǎn)生的小分子有機酸可使降解液pH大大降低[10-11]。因此，烴的降解體系中常常有小分子有機酸共存。草酸是最簡單的二元有機羧酸，有較強的酸性，是自然環(huán)境中微生物酶促反應(yīng)礦化各類污染物的中間產(chǎn)物[12-16]，也是植物常見的代謝產(chǎn)物，尤其是真菌類的代謝產(chǎn)物[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子有機二酸作為共代謝碳源時，能促進銅綠假單胞菌對烴類物質(zhì)降解效率[19]。因此本研究選取草酸作為共代謝碳源，旨在通過實驗掌握草酸對銅綠假單胞菌NY3降解烴類物質(zhì)效果的影響，并對其影響原因、機理做了進一步分析，為利用共代謝機制修復(fù)烴類污染問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 銅綠假單胞菌NY3(屬于假單胞菌屬，革蘭陰性菌)，由本實驗室分離并鑒定[20]。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基制備[21]：NH4NO31 g，磷酸鹽緩沖液(K2HPO4·3H2O 81.22 g，NaH2P O4·2H2O 42.9 g)25 mL，微量元素(FeSO4·7H2O 4.5 g/L，CoCl2·6H2O 0.024 g/L,ZnSO4·7H2O 0.418 g/L,MnSO4·H2O 0.258 g/L,NiCl2·6H2O 10.024 g/L,Na2MoO4·2H2O 0.109 g/L,CuCl2·2H2O 0.017 g/L,H3BO30.062 g/L)1 mL，1 mol/L MgSO4·7H2O 0.5 mL，1 mol/L CaCl2·2H2O 0.1 mL，定容至1 000 mL，調(diào)pH 7.5。121 ℃滅菌30 min后備用。LB培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，調(diào)pH 7.5，溶解于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 NY3菌種子液的制備 NY3在無菌條件下接種于100 mL的 LB培養(yǎng)基中，31 ℃、150 r/min好氧培養(yǎng)24 h，OD600達到1.6±0.05，備用。

1.2.2 草酸對NY3菌以烴為碳源的生長特性的影響作用 取上述無機鹽培養(yǎng)基100 mL于250 mL錐形瓶中，無菌操作下加入150 μL十四烷，外加草酸，使其質(zhì)量濃度分別達到0.5、1.0、2.5、5.0 g/L，調(diào)pH值為(7.5±0.05)，以未加草酸為對照。分別按10%(體積分數(shù))接種。31 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)，定時取樣，測定pH并用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)(cfu/mL)(以此表示菌體生長量)。

1.2.3 草酸共存對NY3菌降解十四烷效率的影響 按照1.2.2的方法制得上述5種培養(yǎng)液，于8 h采樣，同步測定培養(yǎng)液中菌體的生長量(用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)(cfu/mL))和十四烷的去除率。十四烷萃取方法：用正己烷(30～60 ℃)萃取剩余十四烷，十二烷為內(nèi)標，兩組平行樣，利用安捷倫 6890N 單檢測器(GC-FID)測定十四烷的降解率。計算方法：十四烷降解率(%)=((十四烷初始濃度-色譜測定的剩余含量)/初始濃度)×100%。

1.2.4 草酸共存NY3菌生長胞外液降解烴類污染物的作用 取上述無機鹽培養(yǎng)基100 mL于250 mL錐形瓶中，無菌操作下加入150 μL十六烷，外加草酸，使其質(zhì)量濃度達到1 g/L，調(diào)pH值為(7.5±0.05)，按10%(體積分數(shù))接種，以未加草酸為對照體系。31 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng),24 h后采樣離心(4 000 r/min，20 min)，菌體備用，上清液過0.22 μm的水膜得到兩種胞外液。取胞外液各10 mL分別加入30 μL的十四烷，仍以150 r/min，31 ℃恒溫培養(yǎng)，降解8、24、48 h采樣，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待測備用。上述備用的菌體用等體積的無機鹽重懸，取重懸菌液各10 mL分別加入30 μL的十四烷，降解8、24、48 h采樣，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待測備用。

1.2.5 兩種碳源條件下胞外上清液紫外光譜掃描 按照1.2.4方法得到兩種胞外液，以純水為空白用紫外分光光度計進行波長掃描，確定紫外吸收峰區(qū)間。

1.2.6 NY3菌胞外液中PCA的相對含量與其降解十四烷效率的關(guān)系 按照1.2.2的方法投加十六烷、NY3種子液以及不同濃度草酸，使其質(zhì)量濃度達到0.5、1.0、5.0 g/L，調(diào)pH值為(7.5±0.05)，以未加草酸為對照。150 r/min，31 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，按照1.2.4的方法制得胞外液。取胞外液各10 mL分別加入30 μL的十四烷，仍以150 r/min、31 ℃恒溫培養(yǎng)，降解12 h采樣，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待測備用。取上述胞外液各2 mL過固相萃取柱(SupelcleanTM ENVITM-18 3 mL Tubes )，用1 mL甲醇(色譜級)洗脫，利用液質(zhì)聯(lián)用儀測定PCA的含量。

1.2.7 投加PCA對NY3菌胞外液降解十四烷的影響 取上述無機鹽培養(yǎng)基100 mL于250 mL錐形瓶中，無菌操作下加入150 μL十四烷，外加草酸，使其質(zhì)量濃度達到1 g/L，調(diào)pH值為(7.5±0.05)，按10%(體積分數(shù))接種。150 r/min、31℃恒溫培養(yǎng)。24 h后采樣，按照1.2.4的方法離心過膜得到胞外液。在5 mL胞外液中加入10 μL的正十四烷，投加PCA，使其最終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.20和0.50 mg/L。降解12 h采樣，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待測備用。

1.2.8 氣相色譜測定烷烴的方法和條件[22]用安捷倫6890N單檢測器氣相色譜儀(FID檢測器)測定十四烷去除率。氣相條件：5% phenyl Methyl Siloxane HP-5毛細管氣相色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)。載氣：99.99%高純氮氣。氣相方法：進樣口溫度250 ℃，分流比50.0∶1。檢測器溫度300 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min。程序升溫：初始160 ℃，保留1 min，再以20 ℃/min升溫至260 ℃，保留1 min。

1.2.9 飛行質(zhì)譜的測定條件[19]質(zhì)譜條件：流動相A為超純水，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序：0 min，10%B；1 min，10%B；20 min，90%B；23 min，100%B；23.1 min，10%B。流速0.2 mL/min,柱溫40 ℃，樣品室溫度20 ℃，進樣量10 μL。在負離子模式下采集數(shù)據(jù)，采集范圍100～800 m/z。

2 結(jié)果與分析

`2.1 草酸對NY3菌以烴為碳源生長特性的影響

草酸對NY3菌以十四烷為碳源生長及發(fā)酵液pH變化趨勢如圖1所示。由圖1A可知，當NY3菌以十四烷為唯一碳源時，其活菌數(shù)在接種后即迅速增加，并在50 h時達到最大(1.394 8×109cfu/mL)；而當外加草酸質(zhì)量濃度為0.5、2.5、5.0 g/L時，NY3菌生長均受到不同程度的抑制，僅在草酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，NY3菌在50 h生長的活菌數(shù)(1.522 4×109cfu/mL)略高于以十四烷為唯一碳源的體系。超過5次重復(fù)實驗均得到一致結(jié)果：共存草酸不能提高NY3菌細胞生長速度。而圖1B結(jié)果表明，生長液pH變化趨勢大致相同。說明草酸共存作用對NY3菌發(fā)酵液pH并無顯著影響。但34 h后，外加1.0 g/L草酸的體系中，pH下降速度快，說明該體系中烴類降解轉(zhuǎn)化為酸類的速度要快些。

圖1 草酸對NY3菌以烴為碳源生長特性的影響Fig.1 Effects of oxalic acid on the growth characteristics of NY3 with hydrocarbon as carbon source A:草酸對NY3菌以十四烷為碳源的生長曲線；B：草酸對NY3菌以十四烷為碳源的產(chǎn)酸特性A：growth curve of oxalic acid against fourteen strains of NY3 bacteria as carbon source；B：Acid production characteristics of oxalic acid against fourteen strains of NY3 bacteria as carbon source

2.2 草酸共存對NY3菌降解十四烷效率的影響

按照1.2.3中的實驗方法，測定8 h內(nèi)NY3菌生長體系中十四烷降解效率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，各種草酸濃度均對NY3菌降解十四烷有促進作用。

當草酸投加質(zhì)量濃度為0～1.0 g/L時，NY3菌對十四烷的降解率隨投加濃度增加而增加，十四烷去除率最大可提高15.2%；繼續(xù)增加草酸濃度，NY3菌對十四烷的降解率反而降低。因此，適量草酸促進NY3菌對十四烷的降解率，當其質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，促進最為明顯。與8 h相應(yīng)的NY3菌細胞生長量相比，外加草酸對細胞生長有一定程度的抑制，且抑制趨勢與草酸對十四烷降解去除的促進趨勢正好相反。當草酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，NY3菌的生長受到較大抑制，其生長量最低，比不加草酸時降低約15.3%，但烴降解率卻提高了15.2%。

圖2 NY3菌以“十四烷+草酸”碳源生長8 h烴去除效率及其細胞生長量相關(guān)性Fig.2 The correlation of alkanes removal efficiency and cell growth of NY3 which can metabolize the "tetradecane+oxalic acid" as carbon source after 8 h

2.3 草酸共存NY3菌生長胞外液降解烴類污染物的作用

按照1.2.4中實驗方法，NY3菌分別以“C16”和“C16+1.0 g/L草酸”為碳源生長24 h時，離心分離菌體和培養(yǎng)液，分別用該菌體細胞及胞外上清液降解十四烷，降解效率如圖3所示。由圖3A可知，兩種碳源條件下生長的NY3菌細胞，其對十四烷的降解率均隨降解時間延長而增加。兩種菌體細胞在24 h內(nèi)對十四烷的降解率并無顯著區(qū)別，降解48 h時，以“C16+草酸”為碳源生長的菌細胞對十四烷的降解才顯示出明顯優(yōu)勢。而由圖3B可知，利用細胞生長胞外上清液降解十四烷，草酸共存條件下的胞外上清液降解效率明顯提高，胞外上清液降解8、24、48 h時，十四烷降解率分別提高了28.0%、28.1%和26.3%，且48 h內(nèi)這種降解優(yōu)勢幾乎未減弱。因此，共存草酸對NY3菌降解十四烷的促進作用主要存在于胞外液中。

圖3 草酸共存NY3菌生長胞外液降解烴類污染物的作用Fig.3 The effects of extracellular fluid on hydrocarbon pollutants degradation by NY3 which coexistence of oxalic acidA：兩種生長體系中菌體對十四烷的降解率；B：兩種生長體系中胞外液對十四烷的降解率。兩種生長體系的碳源分別為C16和“C16+草酸”無機鹽培養(yǎng)基A：degradation of tetradecane in bacteria of two growth systems；B：degradation of tetradecane in extracellular fluid of two growth systems；The carbon sources of the two growth systems were C16 and ″C16+oxalic acid″ inorganic salt medium respectively

2.4 草酸共存條件下NY3菌生長胞外上清液的特性分析

2.4.1 草酸共存條件下胞外上清液 兩種碳源條件下NY3菌生長胞外上清液外觀特征如圖4所示。由圖4可知，以烴(十六烷)為唯一碳源時胞外上清液呈淡綠色；而草酸共存時胞外液則呈很淺的黃綠色。由于NY3菌是一株銅綠假單胞菌，胞外分泌物十分豐富，其胞外分泌的有色物質(zhì)主要有綠膿菌素(Pyo)、1-羥基吩嗪(1-OH-PHZ)、吩嗪-1-酰胺(PCN)和吩嗪-1-羧酸(PCA)[23]。由于Pyo在pH值為中性時一般為深綠色[7，24]，其顏色深淺與Pyo的濃度相關(guān)，因此，共存草酸可能抑制了NY3菌對Pyo的分泌。共存草酸時胞外液呈現(xiàn)的淺黃色與PCA和PCN的顏色一致。據(jù)此推測，共存草酸顯然改變了NY3菌胞外有色物質(zhì)的分泌。

圖4 草酸共存條件下胞外上清液外觀特征Fig.4 The appearance characteristics of extracellular supernatant in the coexistence of oxalic acid

2.4.2 兩種碳源條件下胞外上清液紫外光譜圖特征 由于NY3菌胞外有色物質(zhì)均有紫外可見吸收，因此，分別測定了購買的四種吩嗪類物質(zhì)純品(Pyo、HPE、PCN和PCA)紫外光譜，同時測定NY3菌在兩種生長碳源條件下胞外液的紫外吸收，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，無論草酸共代謝作用是否存在，NY3菌均能分泌出這四種吩嗪類物質(zhì)。對比兩種生長碳源條件下胞外液的紫外光譜，其差別在于225～285 nm之間的吸收峰。其中共存草酸時，胞外上清液在250 nm左右的吸收峰明顯高于單一碳源時的情形。對比四種吩嗪類純品的紫外可見吸收可知，250 nm正是PCA的一個最大吸收峰。因此，共存草酸可提高胞外上清液中PCA的相對含量增加。

圖5 兩種碳源條件下胞外上清液紫外光譜圖特征Fig.5 Ultraviolet spectra of extracellular supernatants from two kinds of carbon sources

2.5 NY3菌胞外液中PCA的相對含量與其降解十四烷效率的關(guān)系

按照1.2.7中方法提取胞外聚合物。為進一步驗證PCA相對含量增加可明顯提高胞外液對烴的降解效率，按照1.2.6方法，NY3菌以“不同濃度草酸+十六烷”生長24 h，離心，收集胞外液，同時測定胞外液中PCA含量和12 h內(nèi)其對十四烷的降解率，結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，草酸濃度影響胞外液中PCA的含量，而胞外液對十四烷的降解率隨胞外液中PCA分泌量呈正相關(guān)性。同樣的按照1.2.6方法，NY3菌以“1.0g/L草酸+十六烷”生長24h，離心，收集胞外液，分別將不同濃度的純品PCA加入到NY3菌胞外液中，并測定加入PCA后胞外液對十四烷降解率，結(jié)果如圖6B所示。圖6B結(jié)果顯示，隨著NY3菌胞外液中外加PCA含量的增加，其在相同時間內(nèi)對十四烷的降解率增加。該結(jié)果進一步驗證了胞外液中的PCA含量的增加可增加其對十四烷的降解率。

圖6 NY3菌胞外液中PCA的相對含量與其降解十四烷效率的關(guān)系Fig.6 The correlation between the concentration of Phenazine-1-carboxylic acid in extracellular fluid and the synchronous degradation rate of tetradecanein the metabolic system of NY3 A:草酸共代謝體系胞外液中PCA量與其降解十四烷的關(guān)系;B:投加PCA對NY3菌胞外液降解十四烷的影響A:relationship between PCA content in extracellular fluid of oxalate co-metabolism system and degradation of tetradecane;B:the effect of adding PCA on the degradation of tetradecanein by extracellular fluid of NY3 bacteria

3 討 論

研究表明，自然界中能完全礦化污染物的降解菌占總降解菌數(shù)量不到10%，大多數(shù)微生物是通過共代謝作用來降解污染物的[25]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一些有機酸作為共代謝碳源時，能促進銅綠假單胞菌降解烴類物質(zhì)[19]，但是具體的降解機理研究較少。草酸又名乙二酸，是最簡單的二元羧酸，由于分子中是由兩個羧基直接相連,它的酸性比其他二元酸都強，同時也是生物體常見的一種代謝產(chǎn)物。本文研究了草酸作為共代謝碳源對銅綠假單胞菌NY3生長及其降解烴類物質(zhì)的影響，并對其促進降解的具體機理做了初步探索。研究得到以下結(jié)論：①草酸共代謝不能促進NY3菌在降解十四烷過程中的細胞繁殖,但可以促進NY3菌對十四烷的降解效率。草酸對NY3菌降解十四烷的促進作用與其對NY3菌細胞生長趨勢一致,當草酸質(zhì)量濃度為10 g/L時,NY3菌細胞生長抑制作用最大,對十四烷降解率的促進作用也最為顯著,約可提高15.2%。②草酸共代謝不能顯著增加NY3菌細胞對十四烷的降解,但可明顯增加NY3菌胞外液對十四烷的降解。與沒有草酸共代謝體系相比,草酸共代謝體系的胞外液對十四烷的降解率約提高28%。③草酸可提高NY3菌胞外液中PCA的分泌量,PCA分泌量越高,胞外液對十四烷的降解率越高。外加PCA的NY3菌胞外液對十四烷的降解率隨著PCA濃度的增加而增加。因此可以說,草酸可通過促進NY3菌對PCA的分泌而增加其對十四烷的降解效率。

目前研究不僅專注于提高銅綠假單胞菌對烴類物質(zhì)的降解效果，還對其降解的具體機理進行了初步探索，為優(yōu)化NY3菌對石油烴污染的環(huán)境修復(fù)能力提供參考。

參考文獻:

[1] 趙鑫,韓研,梁文,等.銅綠假單胞菌生物降解特性的研究進展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2012,31(40):406-414.

[2] 呂雷,朱米家,王珂.石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(22):7585-7589.

[3] Englert C. Kenzie EJ. Bioremediation of petroleum products in solid [A]. Calabrese EJ, Kostecki PT. Principles and Practices for petroleum contaminated soils[C]. Ann. Arbor.MI, 1992.

[4] Harayama S, Kasai Y, Hara A. Microbial communities in oil-contaminated seawater[J].Environmental Biotechnology, 2004, 15(3):205-214.

[5] Belha A,Desnoues N,Elmerieh C.Alkane biodegradation inPseudomonasaeruginosastrains isolated from a Polluted zone:identifieation ofalkB andalkB-related genes[J].Research in Microbiology,2002,153(6):339-344.

[7] 徐鵬.石油烴代謝菌分泌綠膿菌素對其降解過程的影響作用研究[D]. 西安：西安建筑科技大學(xué), 2013.

[8] O′Malley YQ, Reszka KJ，Spitz DR，et al.Pseudomonasaeruginosapyocyanin directly oxidizes glutathione anddecreases its levels in airway epithelial cells[J]. Eur Biochem,2004,287(1)：94-103.

[9] Reszka KJ, O′Malley Y，McCormick ML, et al. Oxidation of pyocyanin, a cytotoxic product fromPseudomonasaeruginosa, by microperoxidase 11 and hydrogen[J].Free Radic Biol Med, 2004,36(11):1448-1459.

[10] 盧劍.鼠李糖脂在銅綠假單胞菌NY3代謝烴過程中的生理作用研究[D]. 西安:西安建筑科技大學(xué), 2014.

[11] 胡睿.NY3菌發(fā)酵碳源對所產(chǎn)Rha特性影響及其對烴降解促進機理研究[D]. 西安:西安建筑科技大學(xué), 2015.

[12] 黃煥林.二噁烷高效降解菌A.baumanniiDD1的降解特性及其群體感應(yīng)初探[D].杭州：浙江工商大學(xué), 2015.

[13] 李海燕.蒽醌染料的礦化過程及其相關(guān)中間產(chǎn)物分析[J]. 安全與環(huán)境學(xué)報, 2016,16(2):254-257.

[14] 龔丹.蒽醌染料的TiO2光催化降解產(chǎn)物分析及其降解過程研究[D]. 武漢：武漢紡織大學(xué),2013.

[15] 陳小英,劉智武,裘建平,等.紫外-臭氧聯(lián)合礦化水溶液的活性藍19染料[J]. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,38(5):486-490.

[16] 李國亭,曲久輝,張西旺,等.光助電催化降解偶氮染料酸性橙Ⅱ的降解過程研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2009,29(1):175-180.

[17] Bary AD. Comparative morphology and biology of the fungi,mycetozoa and bacteria[J]. Nabu Press, 2015.

[18] Foster JW. Chemical Activities of Fungi[M]. New York: Academic Press,1994:648.

[19] 黃璐.銅綠假單胞菌NY3胞外分泌物對烴類降解的作用研究[D]. 西安：西安建筑科技大學(xué), 2015.

[20] Nie M, Yin X, Ren C, et al. Novel rhamnolipid biosurfactants produced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteriumPseudomonasaeruginosastrain NY3[J].Biotechnology Advances, 2010,28(5): 635-643.

[21] 樊曉宇,聶麥茜,徐鵬,等.左氧氟沙星對銅綠假單胞菌所產(chǎn)表面活性劑特性的影響作用[J].精細化工,2012,29(3):245-249.

[22] 馬霞,聶麥茜,盧劍,等. 鼠李糖脂對銅綠假單胞菌 NY3 表面特性及其烴降解效率的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2014,34(10):2462-2468.

[23] Mavrodi DV, Bonsall RF, Delaney SM, et al. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide fromPseudomonasaeruginosaPAO1[J] Bacteriol,2001,183(21): 6454-6465.

[24] Ernst AH. Friedheim. Pyocyanine, an accessory respiratory pigment[J].Exp.Med,1931,54(2):207-221.

[25] 羅瑋. 難降解污染物微生物共代謝作用研究進展[J]. 土壤通報, 2012,43(6):1515-1521.