侯 旭, 關(guān) 偉, 胡 曉, 袁 雪, 張國慶, 劉悅萍*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京市平谷區(qū)人民政府 果品辦公室，北京 101200；3.北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

桃(PrunuspersicaL.)屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，是我國最重要的果樹資源之一。桃褐腐病是記載最早的桃果實采后病害，目前在我國北京、陜西和云南等地桃園發(fā)生嚴重，一般在采摘前期及采后貯藏期大面積發(fā)病，在北京平谷桃產(chǎn)區(qū)，美澳型核果鏈核盤菌(Moniliniafructicola)是引發(fā)桃褐腐病的優(yōu)勢菌株，病害的發(fā)生使桃果實失去商品價值，對桃產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。目前防治桃褐腐病的主要手段是噴施苯醚甲環(huán)唑，其屬于三唑類化學(xué)殺菌劑(DMI)，但該方法不僅提高了種植成本，遇高溫多雨天氣防效減弱，而且噴施過程中化學(xué)殺菌劑易污染果實表面，使果實品質(zhì)下降[3]。已有研究顯示，該類殺菌劑還會危害人體皮膚和黏膜，產(chǎn)生食品安全問題，影響公眾健康，現(xiàn)今歐洲已有禁止在采摘期的核果類果實上噴灑一切化學(xué)農(nóng)藥的規(guī)定[4]。此外化學(xué)殺菌劑的作用靶點單一，隨著其大量使用，近20年內(nèi)M.fructicola已對DMI類等常用殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[5]。利用生物防治手段能夠安全有效地控制植物病害，不會影響果實品質(zhì)，對人體亦無危害，目前已有很多成功的研究報告[6]。因此找到能夠抑制桃褐腐病的生防菌，研發(fā)相關(guān)生防菌劑是目前桃生產(chǎn)中亟待解決的問題。植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指生活史的一定階段或全部階段處于健康植物組織和器官內(nèi)部的微生物[7]。植物組織內(nèi)普遍存在著內(nèi)生菌，其中有大量的能夠長期穩(wěn)定定殖于宿主組織中，并對宿主產(chǎn)生有益效應(yīng)的菌株[8]。一方面植物體為該類內(nèi)生菌提供其生長必需的能量和營養(yǎng)；另一方面，內(nèi)生菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物，促進植物生長發(fā)育、提高抗逆能力，兩者互惠共生[9]。果樹內(nèi)生菌對果樹和果實品質(zhì)的影響是目前內(nèi)生菌研究的熱點問題，有研究表明，果樹內(nèi)生菌不僅可以很好地防治果樹本身的病害，在果實中定殖，其代謝產(chǎn)物還有促進果樹生長的作用[10-12]。隨著傳統(tǒng)化學(xué)防治法在使用上愈加受限，生物防治必將成為桃褐腐病害綜合治理的重要手段和果樹采后病害防控的研究熱點[13]。目前生防菌的篩選源一般來自土壤，以內(nèi)生菌作為生物防治菌種篩選源的研究較少，且其產(chǎn)生的51%的生物活性物質(zhì)是未知的。而相較其他來源的生防菌，內(nèi)生菌還具有防治效果受外界環(huán)境的變化影響小的優(yōu)點[14]。因此果樹內(nèi)生菌的研究既具有良好的開發(fā)利用前景，又具有理論研究價值[15-16]。本研究分離了桃樹根部的內(nèi)生真菌，初步鑒定了其中對桃褐腐病害有抑制作用的菌株，對其生防機制進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2016年8月，自北京平谷西鹿角村桃園中隨機選取4棵健康的10年樹齡 “大久?！碧覙?，于距離主干半徑30 cm的圓形范圍內(nèi)隨機選取5點，采集距地面15 cm深，直徑約2～3 cm的側(cè)根組織樣品。4 ℃保存運回實驗室，隨后進行內(nèi)生菌株分離。另隨機選取2棵健康的10年樹齡“大久保”桃樹，在同一方向的結(jié)果枝，隨機選取健康完好、成熟度相似的桃果實。

1.1.2 供試病原菌 分離自北京平谷桃園的美澳型核果鏈核盤菌(M.fructicola)，鑒定保存于北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器與設(shè)備 烘箱(WGLL-30BE)，泰斯特公司；冷凍干燥儀(VFD-21S)，日本維爾德公司；光學(xué)顯微鏡(LEICA-MD500)、掃描電鏡(TS-5136SB)、透射電鏡(H-7650)，德國萊卡公司。

1.1.5 試劑 新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP-320，北京天根生化科技有限公司)；次氯酸鈉、戊二醇、磷酸緩沖液、鋨酸、無水乙醇、叔丁醇、丙酮，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Spurr包埋樹脂、醋酸鈾、檸檬酸鉛，北京新興百瑞技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4的分離及抑菌效果 桃樹根部組織樣品經(jīng)75%無水乙醇浸泡30 s，4%次氯酸鈉擦拭表面后，放入無菌水中浸泡2 min，并重復(fù)3次。用滅菌手術(shù)刀將樣品切成1 mm2的薄片，半嵌入PDA(土豆葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基中，每板放入3片。28 ℃暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d后，將內(nèi)生真菌分離純化到斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存，準備下一步實驗。取最后一次浸泡過桃樹組織的無菌水100 μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，置于相同環(huán)境下培養(yǎng)，以檢測樣品表面是否滅菌徹底。以桃褐腐病原菌作為目標菌，采用兩點對峙培養(yǎng)法進行內(nèi)生拮抗真菌的篩選，以內(nèi)徑5 mm的打孔器打取菌種菌餅。只接種桃褐腐病原菌不接種內(nèi)生真菌的PDA培養(yǎng)基作為對照組；提前3 d接種桃褐腐病原菌再接種ZJ-4的PDA培養(yǎng)基作為實驗組1；同時接種內(nèi)生真菌與桃褐腐病原菌的PDA培養(yǎng)基作為實驗組2；提前3 d接種ZJ-4再接種桃褐腐病原菌的PDA培養(yǎng)基作為實驗組3。各組兩菌餅相距3 cm，每組對峙培養(yǎng)重復(fù)3次，置于28 ℃暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，觀察記錄結(jié)果并拍照。測量對照組桃褐腐病原菌菌落生長半徑(RC)，以及實驗組桃褐腐病向內(nèi)生真菌方向生長的距離(RP)，帶入以下公式計算抑菌率，選擇其中抑菌率最高的內(nèi)生真菌進行下一步實驗[17]。抑菌率(%)= ( ( RC-RP) / RC)× 100%。

1.2.2 內(nèi)生拮抗真菌的初步鑒定 將篩選得到的內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4接種于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃環(huán)境下暗培養(yǎng)。參考《真菌鑒定手冊》觀察其菌落生長形態(tài)并記錄拍照[18]。提取內(nèi)生真菌DNA，采用保守序列測定法對內(nèi)生拮抗真菌進行分子鑒定。測序引物為ITS區(qū)通用引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用25 μL的PCR擴增體系：前后引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，ddH2O 10 μL，模板DNA 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫獲取登錄號，通過Blast進行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(MEGA 7.0)。

1.2.3 桃果實離體實驗 將“大久保”桃果實在75%酒精中浸泡30 s，用蘸有4%次氯酸鈉溶液的棉簽擦拭果實表面，無菌水沖洗后用5 mm打孔器在每個桃果實對側(cè)剔除果肉，造成兩個人工創(chuàng)口，創(chuàng)口處放入空白PDA培養(yǎng)基塊和只接種桃褐腐病原菌的作為對照組1和對照組2，兩對照組各取4個桃果實；創(chuàng)口處同時接種內(nèi)生拮抗真菌及桃褐腐病原菌作為實驗組，共接種8個桃果實。實驗組與對照組桃果實均置于30 ℃，濕度為80%的環(huán)境下暗培養(yǎng)，測量記錄發(fā)病創(chuàng)口數(shù)、病斑平均直徑(d)，按公式計算桃果實發(fā)病率以及發(fā)病果上桃褐腐病生長面積：發(fā)病率(%)=(發(fā)病位置個數(shù)/總接種位置個數(shù))×100%，發(fā)病面積=1/4×π×d2。

1.2.4 電子顯微鏡觀察 在兩點對峙實驗平板上，選擇靠近內(nèi)生拮抗真菌且生長受其抑制位置的桃褐腐病菌絲及孢子作為實驗組，另取3個生長天數(shù)與實驗組相同的正常生長的桃褐腐病原菌平板，選擇其菌落邊緣位置的菌體作為對照組，無菌環(huán)境下將目標位置桃褐腐病原菌樣品切成2 mm3正方體樣品。樣品放入裝有2.5%戊二醛的離心管中，常溫固定6 h后，于4 ℃冰箱中保存過夜。隔夜取出樣品，用0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗5次，洗脫后立即放入鋨酸溶液中，常溫固定2 h，再次洗脫。樣品在梯度乙醇中脫水后，經(jīng)常規(guī)方法處理即可使用掃描電鏡及透射電鏡觀察拍照，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4的平板對峙抑菌效果

自桃樹根組織樣品中分離內(nèi)生真菌，經(jīng)篩選得到1株對桃褐腐病原菌生長有抑制效果的拮抗真菌ZJ-4。在平板對峙抑菌效果測定實驗中，先接種桃褐腐病原菌，3 d后再接種ZJ-4，測得抑菌率為69.86%；同時接種桃褐腐病原菌與ZJ-4后，抑菌率為78.81%；先接種ZJ-4，3 d后再接種病原菌，抑菌率達85.33%(表1)。生長靠近ZJ-4的桃褐腐病原菌體上未發(fā)現(xiàn)深褐色的分生孢子簇，菌落邊緣呈擴散狀生長的基內(nèi)菌絲在靠近ZJ-4的菌落后亦無法進一步生長(圖1B、C、D)。

圖1 內(nèi)生真菌ZJ-4對桃褐腐病原菌生長的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of endophytic fungus ZJ-4 on growth of M. fructicolaA：PDA培養(yǎng)基上生長7 d的桃褐腐病原菌；B：先接種桃褐腐病原菌，3 d后再接種ZJ-4，共培養(yǎng)4 d后的菌落形態(tài)；C：桃褐腐病原菌與ZJ-4同時接種，共培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)；D：先接種ZJ-4，3 d后再接種病原菌，共培養(yǎng)4 d后的菌落形態(tài)A: The M. fructicola growth for 7 days on PDA Medium; B: M. fructicola was inoculated firstly, ZJ-4 was inoculated 3 days later, the characteristic of colonial morphology after 4 days co-culture; C: The M. fructicola and ZJ-4 were inoculated simultaneously, the characteristic of colonial morphology after 4 days co-culture; D: ZJ-4 was inoculated firstly, M. fructicola was inoculated 3 days later, the characteristic of colonial morphology after 4 days co-culture

表1 桃內(nèi)生拮抗菌ZJ-4對桃褐腐病原菌生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of endophytic fungus ZJ-4 on growth of M. fructicola

注：表中“±”表示菌落平均半徑的標準偏差；不同字母代表同列數(shù)據(jù)的顯著性差異(P≤0. 05)，下表同

2.2 內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4的初步鑒定

在PDA培養(yǎng)基28 ℃暗環(huán)境下生長7 d后，ZJ-4圓形菌落邊緣呈等經(jīng)輻射狀平鋪生長，菌落初期為白色，后期顏色加深呈現(xiàn)淡黃色，并出現(xiàn)大量子囊殼，生長過程中無滲出物，不產(chǎn)生色素(圖2A)；菌絲有隔膜，氣生菌絲、基內(nèi)菌絲均不發(fā)達，菌絲直徑2.8～3.3 μm(圖2B)；子囊殼為球形，直徑8～12 mm，子囊孢子呈橢圓形，長徑3.4～4.4 μm(圖2C、D)。經(jīng)ITS測序分析，內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4與籃狀菌屬(Talaromyces)的真菌同源性為100%，結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定ZJ-4為籃狀菌屬(圖3)[19]。

圖2 內(nèi)生真菌ZJ-4生長性狀Fig.2 The growth traits of endophytic fungus ZJ-4A：在PDA培養(yǎng)基上生長7 d的ZJ-4；B：ZJ-4的菌絲；C：ZJ-4的子囊殼和子囊孢子；D：ZJ-4的子囊孢子A: The ZJ-4 growth for 7 days on PDA Medium; B: The mycelia of ZJ-4; C: The perithecium and ascospore of ZJ-4; D: The ascospore of ZJ-4

圖3 根據(jù)內(nèi)生真菌ZJ-4的ITS基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The constructed phylogenetic tree based on the ITS gene sequence analysis of the endophytic fungus ZJ-4

2.3 桃果實離體抑菌實驗

在30 ℃、濕度80%的環(huán)境下培養(yǎng)3 d后，接種桃褐腐病菌餅的對照組8個創(chuàng)口發(fā)病率為100%，病斑平均面積為12.6 cm2，且創(chuàng)口周圍有呈環(huán)狀生長的深褐色分生孢子簇(圖4A)；接種空白PDA培養(yǎng)基塊的8個創(chuàng)口未出現(xiàn)染病現(xiàn)象(圖4B)；同時接種ZJ-4以及桃褐腐病菌餅的16個創(chuàng)口發(fā)病率為62.5%，病斑平均面積為0.5 cm2，抑菌率為80%且創(chuàng)口附近未發(fā)現(xiàn)深褐色的桃褐腐病原菌菌絲及分生孢子簇(圖4C、D, 表2)。

圖4 離體桃果實接種內(nèi)生真菌ZJ-4對桃褐腐病生長的抑制效果Fig.4 The inhibitory effects of the peach fruit in vitro inoculated with endophytic fungus ZJ-4 against M. fructicolaA：接種桃褐腐病原菌3 d的桃果實；B：接種PDA培養(yǎng)基塊3 d的桃果實；C、D：同時接種ZJ-4和桃褐腐病原菌3 d的桃果實A: The peach fruits inoculated with M. fructicola for 3 days; B: The peach fruits inoculated with PDA medium for 3 days; C, D: The peach fruits inoculated with M. fructicola and ZJ-4 simultaneously for 3 days

表2 離體桃果實接種內(nèi)生真菌ZJ-4對桃褐腐病生長的抑制效果Table 2 The inhibitory effects of the peach fruit in vitro inoculated with endophytic fungus ZJ-4 against M. fructicola

注：CK1 為接種桃褐腐病菌餅的桃果實；實驗組為同時接種桃褐腐病菌餅以及ZJ-4的桃果實

2.4 內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4對桃褐腐病菌拮抗作用的電鏡觀察

正常生長的桃褐腐病原菌絲自然展開，表面光滑飽滿，平均粗細3～5 μm(圖5A)。與正常生長的菌絲相比，生長受到ZJ-4抑制的菌絲體粗細不均，相互纏繞且表面粗糙，部分位置菌絲干癟(圖5B)。桃褐腐病原菌正常生長的分生孢子一般呈檸檬狀，表面光滑飽滿且充盈，長7～9 μm，寬6～8 μm(圖5C)。受到ZJ-4抑制的桃褐腐病分生孢子畸形現(xiàn)象嚴重，表面粗糙不平，且普遍存在干癟凹陷的現(xiàn)象(圖5D)。

正常生長的桃褐腐病原菌的細胞中，可明顯觀察到胞質(zhì)溶膠充滿整個細胞(圖6A)，而生長受到ZJ-4抑制的桃褐腐病細胞的胞質(zhì)溶膠收縮凝聚，細胞壁內(nèi)出現(xiàn)大量不規(guī)則空腔(圖6B、C、D)。

圖5 內(nèi)生真菌ZJ-4對桃褐腐病原菌絲及分生孢子的影響Fig.5 The effect of endophyte fungus ZJ-4 on the mycelia and conidium of M. fructicolaA：正常生長的桃褐腐病原菌絲；B：受到ZJ-4抑制的桃褐腐病原菌絲；C：正常生長的桃褐腐病原菌分生孢子；D：受到ZJ-4抑制的桃褐腐病原菌分生孢子A: The normal mycelia of the M. fructicola; B: The mycelia of M. fructicola inhibited by ZJ-4; C: The normal conidium of the M. fructicola; D: The conidium of M. fructicola inhibited by ZJ-4

圖6 內(nèi)生真菌ZJ-4對桃褐腐病菌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 The effect of endophyte fungus ZJ-4 on the ultrastructure of the M. fructicola cellsA：正常生長的桃褐腐病原菌細胞；B、C、D：生長受到ZJ-4抑制的桃褐腐病原菌細胞A: The normal cell of the M. fructicola; B, C, D: The cell of M. fructicola inhibited by ZJ-4

3 討 論

由美澳型核果類褐腐病菌(Moniliniafructicola)引發(fā)的桃褐腐病害嚴重影響了我國桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為消除化學(xué)防治帶來的環(huán)境污染和對人體的危害，防治桃褐腐病害的生防菌及其菌劑的研發(fā)成為目前重要的研究課題[20]?，F(xiàn)已報道的能夠防治桃褐腐病害的生防菌，其篩選源主要為土壤和有廣譜抑菌效果的植物組織，從桃樹組織中分離內(nèi)生菌以防治其自身病害的研究目前較少[21]，而內(nèi)生生防菌具有能夠在植株中穩(wěn)定定殖、上下傳導(dǎo)，不影響植株生長的優(yōu)點，因此其研究結(jié)果具有重要的科學(xué)和實用意義[22-23]。

本研究自桃樹組織中分離到1株對桃褐腐病原菌生長有明顯抑制作用的內(nèi)生真菌ZJ-4，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS分子鑒定為籃狀菌屬真菌(Talaromyces)。平板對峙實驗顯示，先接種ZJ-4，3 d后再接種桃褐腐病原菌，抑菌率可達85%?；@狀菌屬真菌是目前極為重要的生防真菌之一，其能通過重寄生的方式廣譜抑制多種植物病原真菌的生長，還能夠向胞外分泌具有抗菌活性的幾丁質(zhì)酶等抑菌物質(zhì)，這些抑菌活性物質(zhì)能破壞病原菌的孢子、芽管和菌絲，對核盤屬病原真菌有強烈的抑制作用[24-25]。目前有較多的研究證實了籃狀菌屬真菌的抑制效果，Naraghi等[26-27]自土壤中分離得到14株籃狀菌屬真菌，其中1株對番茄黃萎病和黃瓜枯萎病的病原菌生長有明顯抑制作用，其還能有效防治茄子和棉花的真菌病害。魏彩燕等[28]自草莓炭疽病組織中發(fā)現(xiàn)1株具有廣譜抗菌性的真菌MT-06，經(jīng)鑒定為籃狀菌屬真菌中的黃籃狀菌。Ghanbari等[29]篩選得到的3株籃狀菌屬真菌，其胞外代謝產(chǎn)物對小麥全蝕病原菌生長的抑制效果最高達73%。咸洪泉等[30-31]將籃狀菌屬真菌中黃籃狀菌的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母，其表達代謝并胞外分泌的大量活性物質(zhì)能夠很好地抑制板栗疫病、煙草赤星病和玉米彎孢病等6種植物病原真菌的生長。此外Yamagiwa[32]發(fā)現(xiàn)籃狀菌屬真菌FS2能夠產(chǎn)生促進植物生長發(fā)育的代謝產(chǎn)物，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明籃狀菌屬真菌是重要的生防菌資源。

研究顯示內(nèi)生真菌能夠在植物組織中穩(wěn)定定殖，部分代謝產(chǎn)物可以防治植物病害且不會引發(fā)農(nóng)藥殘留等食品安全問題，對其抑菌機理等問題現(xiàn)已開展了較多研究[33-34]。本研究中，平板對峙實驗和果實回接抑菌實驗ZJ-4均表現(xiàn)出明顯的抑制桃褐腐病原菌絲生長、孢子萌發(fā)的效果；經(jīng)過掃描和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ZJ-4對桃褐腐病菌絲與分生孢子均有顯著的致畸、破壞作用，對其細胞質(zhì)有凝聚作用。觀察過程中并未在生長受到抑制的桃褐腐病組織里發(fā)現(xiàn)ZJ-4的菌體，這表明ZJ-4向胞外分泌了有抑菌效果的代謝產(chǎn)物且發(fā)揮作用，這與Naraghi等[35]在使用籃狀菌屬真菌抑制土豆黃萎病原真菌時觀察到的結(jié)果類似；劉愛新等[36]使用電子顯微鏡觀察生長受到幾丁質(zhì)酶抑制的煙草赤星病原菌后，發(fā)現(xiàn)了病原菌體畸形、細胞溶膠凝聚、質(zhì)壁分離形成空腔的現(xiàn)象。目前的研究顯示籃狀菌屬真菌可能通過向胞外分泌抑菌物質(zhì)，致使離體桃果實上的桃褐腐病原菌菌絲和孢子嚴重畸形、胞質(zhì)分離，從而有效地抑制其生長。

基于上述結(jié)果，本課題組將對內(nèi)生真菌ZJ-4胞外分泌的代謝產(chǎn)物及其抑菌作用機理做進一步研究，并探索其在果實上定殖情況、存活期和持效期等，為研發(fā)防治桃褐腐病的生物制劑提供參考。

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