王世偉， 王卿惠， 馬兆魁， 李小鵬， 張其法， 唐海平

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù) 黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鐮刀菌屬(Fusariumsp.) 為真菌中較大一屬，具重要學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鐮刀菌能產(chǎn)生重要酶類，如纖維酶[1-3]、果膠酶[4]、木聚糖水解酶[5-6]等。通過生物轉(zhuǎn)化可獲得重要藥物中間體或藥物[7-9]。因此，鐮刀菌在食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有重要作用。鐮刀菌能降解有毒物質(zhì)，在生物脫除氮氧化物，生物降解酚類、氰化物，吸收、蓄積、降解多環(huán)芳烴等方面發(fā)揮著巨大作用[10]，在環(huán)境保護(hù)中具潛在應(yīng)用價(jià)值[11]。但是，鐮刀菌屬是最難鑒定的屬之一，形態(tài)學(xué)鑒定準(zhǔn)確性不足，直接影響該菌株催化機(jī)制的深入研究[12]。鐮刀菌分子鑒定彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定不足，已成為區(qū)分物種、變種、地理株的有效手段[13]，廣泛應(yīng)用于鐮刀菌屬之間親緣關(guān)系研究[14]，特別是核糖體DNA(rDNA)在不同鐮刀菌種間、甚至同種分離株間存在著高度變異等特點(diǎn)，因此成為鐮刀菌鑒定理想方法[15]。本研究從黑龍江北大倉(cāng)集團(tuán)有限公司白酒大曲中分離了1株高產(chǎn)纖維素酶真菌M1，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)綜合分析，鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。該菌能生產(chǎn)高活性纖維素酶,經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化纖維素酶活力進(jìn)一步提高。通過層析使酶純化至同質(zhì)，為進(jìn)一步研究該酶催化機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 黑龍江北大倉(cāng)集團(tuán)有限公司釀酒車間使用的北大倉(cāng)白酒大曲(Daqu)；ITS1/ITS4通用引物由上海生工(Sangon Biotech)合成，Taq酶和dNTP購(gòu)自上海生工。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(固體加2%瓊脂)；剛果紅培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：(NH4)2SO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.1，NaCl 0.05，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.0，剛果紅 0.02，瓊脂 2.0，pH 7.5。粗酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：CMC-Na 4，酵母浸出膏5，胰蛋白胨10，NH4Cl 5，MgSO41，K2HPO41，KH2PO41，蒸餾水1 L，pH自然,其他藥品均為分析純。

1.1.3 儀器 朗基多功能PCR儀(MG96+/YPCR)購(gòu)自廣州飛迪生物科技有限公司；Alpha 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司;蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及產(chǎn)酶分析 稱取0.1 g大曲，在無(wú)菌條件下接入250 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水，120 r/min室溫?fù)u床活化2 d。取1 mL活化液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋，取10-3稀釋度的活化液涂布于20個(gè)PDA固體平板(每板100 μL)。30 ℃倒置培養(yǎng)3 d待菌落長(zhǎng)出，然后挑取單菌落接種于PDA固體平板進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。將標(biāo)記為M1的純培養(yǎng)菌接種于PDA平板，30 ℃培養(yǎng)5 d待長(zhǎng)出菌落，肉眼觀察記錄；將M1菌接種于PAD液體培養(yǎng)基，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)3 d，然后靜止培養(yǎng)3 d，待液體培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌醭(pellicle)；挑取少量菌醭，無(wú)菌條件下制片進(jìn)行顯微觀察，對(duì)M1菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。在無(wú)菌操作臺(tái)下，用無(wú)菌接種環(huán)挑去菌醭(約1 mm2)轉(zhuǎn)接到剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基上(挑取3次，轉(zhuǎn)接到不同的部位)。28 ℃，倒置培養(yǎng)3 d，觀察是否產(chǎn)生透明圈。根據(jù)透明圈有無(wú)判斷該菌是否產(chǎn)生纖維素酶。

1.2.2 rDNA-ITS鑒定 取長(zhǎng)好的菌醭3～4 g，無(wú)菌水沖洗2～3次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分，液氮研磨備用。按文獻(xiàn) [16] 提供的SDS方法提取M1真菌的DNA，ITS區(qū)段的PCR 擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1/ITS4。上游引物ITS1：TCCGTAGGT GAACCTGCGG，下游引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。①PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，上下游引物(20 μmol/L)各2 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，模板DNA 2 μL，去離子水30.5 μL。②PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火 50 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，與2 μL 6×loading 混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1%)電泳，電泳后凝膠在數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)上分析、照相，剩余的PCR產(chǎn)物送上海生工長(zhǎng)春分部測(cè)序。將所得真菌M1的rDNA ITS 序列輸入GenBank中，獲得GenBank登陸號(hào)，并通過Blast比對(duì)獲得相似性最高的序列，確定真菌M1的分屬地位。參照數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登記的其他真菌的rDNA ITS范圍，對(duì)本研究中的真菌M1的rDNA ITS序列進(jìn)行界定。 用MEGA5.05軟件中的Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，再選用非加權(quán)組平均法(UPGMA)中的最大似然法(Maximum like lihood tree)模塊構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 纖維素酶活性及發(fā)酵條件優(yōu)化 將M1菌株3環(huán)轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、120 r /min 搖瓶培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)液8 000 ×g 離心15 min，由于纖維素酶屬于胞外酶，因此上清液即為該菌產(chǎn)生的纖維素酶粗酶液。本研究完全按照國(guó)標(biāo)(QB 2583-2003)相關(guān)方法對(duì)真菌M1的纖維素酶活性進(jìn)行測(cè)定。按附錄B所述方法，通過測(cè)定纖維素酶降解底物濾紙和羧甲基纖維素鈉生成的還原糖來(lái)反映纖維素酶的總酶活力。前者酶活力為濾紙酶活力(FPA)，一般表示全酶活性；后者酶活力為羧甲基纖維素酶活力(CMCA)，基本反映了內(nèi)切酶活力。酶活定義為1 mL粗酶液在50 ℃，pH 6.0，1 h水解底物(濾紙或CMC-Na)，生成相當(dāng)于1 mg葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。采用二硝基水楊酸(DNS)試劑測(cè)定產(chǎn)生的還原糖的量。①優(yōu)化溫度對(duì)粗酶酶活性的影響：在原始發(fā)酵條件(自然pH)不變的情況下，改變發(fā)酵溫度，采用不同的溫度(20、30、35、45、50 ℃)進(jìn)行發(fā)酵，研究溫度對(duì)粗酶發(fā)酵液酶活性的影響；②初始pH對(duì)粗酶酶活的影響：在最優(yōu)溫度發(fā)酵條件下，以400 mmol/L的檸檬酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，產(chǎn)生不同的pH梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后研究初始pH對(duì)酶活的影響。

1.2.4 纖維素酶的純化和酶學(xué)性質(zhì) 采用考馬斯亮蘭法測(cè)定各部層析液蛋白質(zhì)含量[17]；酶活的測(cè)定方法同QB 2583-2003標(biāo)準(zhǔn)；采用PAGE測(cè)定酶蛋白的純度，濃縮膠為4%，分離膠為12%。在最優(yōu)發(fā)酵條件下對(duì)M1菌株進(jìn)行培養(yǎng)，離心獲得纖維素酶的粗酶液，使用30%～70%飽和度硫酸銨(ASF)對(duì)粗酶液進(jìn)行分級(jí)分離，方法參照文獻(xiàn)[18]。獲得的經(jīng)分級(jí)分離樣品記作ASF。ASF經(jīng)濃縮、過濾后直接上樣于疏水層析柱(Bio-Rad Duo Flow)，疏水層析柱為Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (2.0 cm×23 cm)，每次進(jìn)樣2～3 mL。先用buffer B (1 mol/L (NH4)2SO4)對(duì)柱進(jìn)行平衡，使沒有結(jié)合在柱子上的雜蛋白與柱分離，將未結(jié)合雜蛋白盡量去除，然后用40%～0%硫酸銨(25 mmol/L PBS, pH 7.4)溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為4 mL/min。等度洗脫使用25 mmol/L PBS buffer 120 mL 以4.0 mL/min的流速?zèng)_洗。表現(xiàn)最大酶活力峰收集后，經(jīng)透析、濃縮后獲得的樣品記作HIC。HIC樣品經(jīng)透析除鹽、超濾管(Milipore Amicon Ultra-15(10 kD))濃縮后，進(jìn)樣于DEAE-Sepharose FF( 2.0 cm×23 cm )柱。進(jìn)樣后用25 mmol/L S buffer (pH 7.2 ) 以3.0 mL/min的流速平衡洗脫，去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。然后用60%～100%硫酸銨逐漸上升的濃度進(jìn)行洗脫，流速為4.5 mL/min。最后以流速為2.0 mL/min的1.0 mol/L (NH4)2SO4進(jìn)行等梯度洗脫。表現(xiàn)最大酶活力的峰收集起來(lái)，樣品經(jīng)透析、凍干濃縮獲得的濃縮液記作DEAE。然后進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌M1形態(tài)學(xué)初步鑒定

鐮刀菌有性時(shí)期分別屬于肉座菌科(Hypocreaceae)的赤霉屬(Gillerella)、叢赤殼屬(Nectria)、麗赤殼屬(Calonectria)和小赤殼屬(Micronectriella)等。除Gillerellazea極為常見和易培養(yǎng)外，大部分種類在培養(yǎng)基上較少形成子囊殼，而且有些種類至今未發(fā)現(xiàn)有性時(shí)期，因此在鐮刀菌鑒定上主要根據(jù)無(wú)性時(shí)期的形態(tài)特征。圖1為分離自北大倉(cāng)白酒大曲的真菌M1菌株經(jīng)純培養(yǎng)后接種到固體PAD平板上的菌落形態(tài)。從圖1可見，在PDA培養(yǎng)基上，菌落為白色，呈絮狀突起、質(zhì)密，由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)，菌落高2～3 mm，與鐮刀菌菌落形態(tài)一致。

圖1 大曲真菌M1菌落形態(tài)Fig.1 Characteristics of bacterial colonies from the fungus M1 strain

圖2為PDA平板菌落的顯微觀察結(jié)果。圖2 A、B、C和D為同一張制片的不同視野下觀察的結(jié)果。圖2A為M1菌株的菌絲形態(tài)，圖2B為菌株M1小孢子的大小、形狀和分布狀態(tài)，圖2C為分生孢子梗和大型分生孢子著生方式和形態(tài)，圖2D為菌株的厚垣孢子形態(tài)。尖孢鐮刀菌在自然條件或人工培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生小型和大型分生孢子、分生孢子梗和厚垣孢子。如圖2B、C、D所示，小型分生孢子無(wú)色，單胞，卵圓形、瓜子型等；大型分生孢子無(wú)色，多胞，鐮刀形，略彎曲，兩端細(xì)胞稍尖，少許彎曲，有隔；分生孢子梗分枝；厚垣孢子淡黃色，近球形，表面光滑，壁厚，間生、單生或串生，對(duì)不良環(huán)境具有抵抗力。從形態(tài)學(xué)觀察可以判斷菌株M1為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)。

圖2 大曲真菌M1的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.2 Characteristics of the fungus M1 strain isolated from Dq of Beidacang spirit under microscopeA：菌絲形態(tài)；B：小孢子形態(tài)；C：分生孢子梗和大孢子形態(tài)；D：厚垣孢子A:Hypha;B:Micoroconidia;C:Conidiophore and Macroconidia;D:chamydospore

2.2 M1菌株產(chǎn)纖維素酶的檢驗(yàn)

纖維素酶是一類能夠水解纖維素的β-1，4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱[19]。它是一種復(fù)合酶，纖維素徹底降解為葡萄糖至少需要內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1，4 -glucanases，EC 3.2.1.4) 、外切葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanases，EC 3.2.1.91) 和β-葡萄糖苷酶( β-1，4-glucosidases，EC 3.2.1.21)3個(gè)組分協(xié)同作用[20]。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無(wú)定型區(qū)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶(纖維二糖酶)水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。剛果紅(Congo red)本身能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解為寡糖或葡萄糖后，紅色復(fù)合物無(wú)法形成，培養(yǎng)基中出現(xiàn)了以供試菌為中心的透明圈。如圖3所示，在剛果紅平板上接種的鐮刀菌屬(Fusariumsp.) M1產(chǎn)生了明顯的透明圈，透明圈直徑約為2～5 cm，說明菌株M1具有纖維素分解能力。

圖3 M1菌株的剛果紅染色結(jié)果Fig.3 Congo red staining of the fungus M1 strain

2.3 真菌M1的rDNA ITS片段PCR擴(kuò)增

2.3.1 真菌M1的DNA提取 圖4為提取到的M1菌株DNA樣品在1% agarose凝膠電泳圖。DNA Marker為限制性核酸內(nèi)切酶Hind III 切割λDNA的產(chǎn)物。自上而下片段大小分別為23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564和125 bp。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA樣品在凝膠中清晰可見1條帶；2.3 kb以下，條帶完整無(wú)降解，說明可作為下一步PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

圖4 M1的DNA提取后電泳結(jié)果Fig.4 Results of electrophoresis from DNA extraction of the fungus M1 isolated from Dq of Beidacang spirit (Agarose 1%)M：-λHind III digest DNA Marker

2.3.2 rDNA ITS片段PCR結(jié)果 本研究選用了一對(duì)擴(kuò)增真菌rDNA基因片段的通用引物(TIS1/TIS4)。該引物通過PCR擴(kuò)增能獲得轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和28S rRNA的基因序列，廣泛用于真菌分類的鑒別。如圖5所示，使用λ-Hind III digest DNA Marker在1.8%的瓊脂糖凝膠下電泳，獲得了清晰的電泳圖。除Marker外，其他泳道分別為不同管中的PCR產(chǎn)物，分別為P1、P0、P2、P3和P4，其中P0為空白對(duì)照(只加入了2 μL 6×PCR loading)。P1、P3樣品的加入量均為4 μL，P2、P4樣品的加入量均為8 μL。從圖5可看出，除對(duì)照P0外，其他樣品電泳后在Marker的564 bp附近都出現(xiàn)了明亮的條帶，在564 bp標(biāo)準(zhǔn)條帶偏下出現(xiàn)。各泳道PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)其他雜帶，擴(kuò)增出片段符合預(yù)期值500 bp左右；且條帶清晰、完整、明亮，說明擴(kuò)增產(chǎn)物品質(zhì)較好，可進(jìn)行DNA測(cè)序。將PCR反應(yīng)剩余P1、P2、P3和P4四種樣品管用膠帶封好，寄送上海生工長(zhǎng)春測(cè)序分部進(jìn)行測(cè)序。

圖5 真菌M1 rDNA ITS片段的PCR擴(kuò)增圖譜(1.8% agarose)Fig.5 rDNA ITS profiles of fungus M1(1.8% agarose)

2.4 真菌M1 rDNA ITS序列的Blast比對(duì)

2.4.1 rDNA ITS片段PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 上述4管PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明其PCR產(chǎn)物序列一致。使用DNAman分析軟件對(duì)DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列大小為506 bp，GC含量占50%。

2.4.2 序列提交NCBI的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì) 將真菌M1 rDNA ITS序列提交至NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)GenBank: KY436001.1。Blast比對(duì)分析結(jié)果顯示，真菌M1的rDNA ITS序列與GenBank 中其他鐮刀菌屬(Fusarium)菌株序列的相似性高達(dá)99%。將相關(guān)鐮刀菌屬代表菌株rDNA序列下載后，使用Mega5.0分析軟件，同F(xiàn)usariumsp. M1的rDNA ITS序列進(jìn)行Blast比對(duì)，采用最大似然法構(gòu)建聚類分析圖(圖6)。如圖6所示，F(xiàn)usariumsp. M1(KY436001.1)與Fusariumoxysporimstrain Bt3聚為一類，親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)99%，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果完全一致。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察將Fusariumsp. M1確定為尖孢鐮刀菌，命名為FusariumoxysporimM1。

2.5 真菌M1產(chǎn)纖維素酶活性分析

2.5.1 M1菌株優(yōu)化前酶活性的測(cè)定結(jié)果 采用國(guó)標(biāo)(QB 2583-2003)方法，分別以濾紙和CMC-Na為底物，測(cè)定FusariumoxysporimM1菌株的纖維素酶活性，結(jié)果見表1。從表1可以看出，鐮刀菌FusariumoxysporimM1的濾紙酶活性為181.32

圖6 Fusarium sp.M1 rDNA ITS最大似然樹分析Fig.6 Maximum likelihood treeanalysis of rDNA ITS for strain Fusarium sp.M1

U/mL，相當(dāng)于國(guó)際單位為16.8 IU/mL；CMCA活性為379.21 U/mL，相當(dāng)于國(guó)際單位為35.25 IU/mL。說明鐮刀菌具高纖維素分解能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMCA比FPA高許多，以不同纖維材料為底物測(cè)試同一種纖維素酶系并以還原糖的產(chǎn)生作標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得到的酶活力值也不同[20]。濾紙是不溶性的，而CMC-Na為可溶性的。張瑞萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)CMCase比FPA高，說明酶對(duì)水溶性底物有較高活力，吸附對(duì)酶活性部位與纖維素分子鏈結(jié)合及催化均有影響。陸晨等[22]從森林腐質(zhì)土壤中分離篩選得到1株高產(chǎn)纖維素酶的真菌B-5，以羧甲基纖維素鈉為碳源，蛋白胨為氮源，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)5 d，初始酶活FPA 酶活(FPase) 僅為2.09 IU/mL，CMC 酶活(CMCase)為5.20 IU/mL。韓寒冰等[23]研究菌株XA-1纖維素酶活力，發(fā)現(xiàn)最高CMCase 和FPA分別為318.44 U/mL和61.35 U/mL。Shang等[2]從土壤和腐爛稻草中分離出FusariumoxysporumF5具高纖維素降解能力，CMCA活力高達(dá)19.8 IU/mL。本研究分離的菌株FusariumoxysporimM1纖維素酶活性相對(duì)較高。

表1 菌株Fusarium oxysporim M1的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of the cellulose activity assay from Fusarium oxysporim M1 strain

2.5.2 M1菌株優(yōu)化后酶活性測(cè)定結(jié)果 不同溫度下菌株FusariumoxysporimM1的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果見表2。從表2可知，與原始的發(fā)酵條件(30 ℃)相比，20 ℃時(shí)全酶(FPA)和CMCase的活性均低于對(duì)照組的酶活，但降低的幅度不大；在35 ℃時(shí)，兩種酶活性均略高于對(duì)照，分別為17.34和36.42 IU/mL；但在45和50 ℃時(shí)，酶活性明顯降低。因此該纖維素酶的最佳發(fā)酵溫度應(yīng)為35 ℃。不同pH下菌株FusariumoxysporimM1的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果見表3。從表3可知，在自然pH 7.0為對(duì)照并以優(yōu)化溫度35 ℃為發(fā)酵條件，不同pH(6.0～8.0)范圍內(nèi)，對(duì)全酶的活性影響不大，pH 5.0酶活降低，pH 9.0酶活降低明顯，最適pH為6.0。結(jié)合表2和表3可知，經(jīng)溫度和pH優(yōu)化，獲得最佳纖維素酶活性分別為FPA(17.91 IU/mL)和CMCA-DNS(37.97 IU/mL)，酶活性通過優(yōu)化有所提高。

表2 不同溫度下菌株Fusarium oxysporim M1的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果(IU/mL)Table 2 The results of the cellulose activity assay from Fusarium oxysporim M1 strain in different temperature (IU/mL)

表3 不同pH下菌株Fusarium oxysporim M1的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果(IU/mL)Table 3 The cellulose activity assay from Fusarium oxysporim M1 strain in different pH values (IU/mL)

2.6 真菌M1產(chǎn)纖維素酶純化與檢驗(yàn)分析

2.6.1 純化表分析 表4歸納了真菌M1產(chǎn)纖維素酶純化過程和各個(gè)步驟的酶活測(cè)試結(jié)果，包括比酶活和純化倍數(shù)以及得率等重要的純化參數(shù)。整個(gè)純化包括粗液的制備、硫酸銨分級(jí)分離(ASF)、疏水作用層析(HIC)和離子交換層析(DEAE)。從表4可知，粗酶液的酶活力為37.97 IU/mL(MCA-DNS)，經(jīng)過各步驟純化后酶活性達(dá)到69.79 IU/mL。最后一步(離子交換)酶被純化了17.7倍，得率為3.76%。說明純化方法比較合理。從整個(gè)純化方案上看，經(jīng)過硫酸銨分級(jí)分離，酶液體積大大縮小，便于后續(xù)的層析操作；同時(shí)獲得的樣品可直接進(jìn)樣疏水層析，無(wú)須經(jīng)過透析，可節(jié)省大量時(shí)間。整個(gè)操作過程始終處于0 ℃，保證了酶的穩(wěn)定性和活力，也增加了酶的純化倍數(shù)。

表4 菌株M1產(chǎn)纖維素酶的純化表Table 4 Purification of cellulase from Fusarium oxysporim M1 strain

2.6.2 純酶的電泳分析 圖7為2步層析后經(jīng)透析除鹽獲得樣品的SDS-PAGE電泳圖。如圖7所示，經(jīng)過疏水層析，在30 kDa～24 kDa范圍內(nèi)，還有至少3條明顯的雜蛋白條帶，但經(jīng)過離子交換層析后這些雜蛋白已經(jīng)完全去除。在62 kDa～40 kDa之間有一條明顯的條帶，大小約為60 kDa,說明純化的纖維素酶的分子量大小為60 kDa左右。纖維素酶是多組分的酶系，整個(gè)纖維素降解是內(nèi)切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶協(xié)調(diào)作用實(shí)現(xiàn)的。上述纖維素酶純化方案是以羧甲基纖維素鈉為直接作用的底物催化而設(shè)計(jì)的，因此純化的纖維素酶的具體酶學(xué)特性以及高效催化機(jī)制有待研究。

圖7 菌株M1纖維素酶純化的SDS-PAGE電泳分析Fig.7 SDS-PAGE of Cellulase purified from Fusarium sp.M1

3 討 論

本研究從北大倉(cāng)白酒大曲分離鑒定了1株高產(chǎn)纖維素酶的真菌，通過rDNA ITS序列分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定該菌為尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporimM1)，不僅證明了鐮刀菌的分子生物學(xué)鑒定的可靠性，豐富了北大倉(cāng)白酒大曲的微生物多態(tài)性，同時(shí)也為高產(chǎn)纖維素酶的鐮刀菌菌種資源的開發(fā)、利用提供參考。酶的純化研究是研究鐮刀菌產(chǎn)纖維素酶其他機(jī)制的基礎(chǔ)。對(duì)純酶的研究避免了細(xì)胞環(huán)境條件的影響，為進(jìn)一步研究這種高效分解纖維素酶的作用機(jī)理以及酶結(jié)構(gòu)和功能提供了數(shù)據(jù)。本研究也為今后從鐮刀菌纖維素酶基因和蛋白質(zhì)工程角度出發(fā)，構(gòu)建產(chǎn)纖維素酶高產(chǎn)工程菌株，使鐮刀菌資源更廣泛地應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域提供參考。

參考文獻(xiàn):

[1] Olajuyigbe FM, Nlekerem CM, Ogunyewo OA. Biodegradation of Methyl Cellulose byFusariumoxysporum[J]. Biochemistry Research International, 2016,(1):3978124.

[2] Shang TT, LI QT, Shanggui DENG.Screening and Isolation of Highly Efficient Cellulose-degrading Microorganisms andConstruction of Complex Microbial System[J].Agricultural Science & Technology, 2015, 16(4): 639-644, 652.

[3] 常鑫園，謝占玲，張鳳梅，等．鐮刀菌 Q7-31T 內(nèi)切葡聚糖酶 Egn21 的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]．微生物學(xué)報(bào)，2017, 57(1)：33-42.

[4] 李文強(qiáng)，吳菲菲，李化強(qiáng)，等．金屬離子對(duì)尖孢鐮刀菌發(fā)酵液中果膠酶活性的影響[J]．邵陽(yáng)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，12(4)：50-56.

[5] 趙聯(lián)正，謝占玲 趙朋,等．一種新的鐮刀菌Q7-31木聚糖酶Xyn9的分離純化鑒定及酶學(xué)特性[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015，43(5)：42-45.

[6] Sara G, Payne AM, Martin S, et al. Structural and functional characterization of a highly stable endo-β-1,4-xylanase fromFusariumoxysporumand its development as an efficient immobilized biocatalyst[J]. Biotechnology for Biofuels, 2016, 9(1):191.

[7] 代文亮，陶文沂，程龍．紫杉醇產(chǎn)生菌美麗鐮刀霉K178的誘變育種[J]．中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(4)：251-257.

[8] 鄧立新，舒正玉，夏曉峰，等．環(huán)孢菌素A產(chǎn)生菌的分子鑒定及其原生質(zhì)體制備[J]．福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，24(2)：63-79.

[9] 生措，任杰，王敏，等．不對(duì)稱還原α-氨基苯乙酮菌種的篩選及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2012，18(2)：281-286.

[10] 譙建軍，田萍，姚秉華，等．染料結(jié)晶紫降解菌分離及其特性研究[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2006，2(7)：62-65.

[11] 蔡偉建，潘俊雅，李濟(jì)吾．鐮刀菌(Fusariumsp．) 對(duì) 2，4，6-三氯苯酚的降解特性及其機(jī)制[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36(9)：1387-1392.

[12] 鄭平．環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]．杭州：浙江大學(xué)出版社，2005.

[13] 張向民. 鐮刀菌屬分類學(xué)研究歷史與現(xiàn)狀[J].菌物研究,2005，3(2):59- 62 .

[14] Visentin I, Tamietti G, Valentino D, et al. The ITS region as a taxonomic discriminator betweenFusariumverticillioidesandFusariumproliferatum[J]. Mycological Reseach, 2009, 113(10): 1137-1145.

[15] 孫勇，繆倩，孫穎，等．6 種植物中內(nèi)生鐮刀菌的分離和鑒定[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(5)：437-439.

[16] 王世偉，董原，李鐵，等．一種適合抗癌藥紫杉醇產(chǎn)生菌AFLP分析的DNA提取方法[J]．高師理科學(xué)刊，2006，26(1)：60-64.

[17] 牛青霞，申濟(jì)奎.微量考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2001,2(5):345-347.

[18] 鄭金花，郁建平.鐮刀菌發(fā)酵培養(yǎng)液中纖維素酶的分離純化[J].化學(xué)與生物工程,2010,27(12):65-68.

[19] 池雅琴，黃奎．纖維素酶活力測(cè)定方法研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，2010(24)：32-34.

[20] 余興蓮，王麗，徐偉民.纖維素酶降解纖維素機(jī)理的研究進(jìn)展[J]．寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版)，2007，20(1)：78-82.

[21] 張瑞萍．纖維素酶活力測(cè)定方法[J]．印染, 2002, 28(8):38-39.

[22] 陸晨，陳介南，王義強(qiáng)，等．一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]．中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(6)：118-122.

[23] 韓寒冰，程水明，劉杰鳳.一株產(chǎn)纖維素酶鐮刀菌的篩選、鑒定與酶學(xué)性質(zhì)[J]．現(xiàn)代化工，2014,34(7):61-65.