史 彬， 黃魏魏， 付丹妮， 董祥洲， 任立偉， 朱啟法， 劉永民*

(1．遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001； 2．安徽皖南煙葉責任有限公司，安徽 宣城 242000；3．清華大學 化學工程系，北京 100084)

秸稈是僅次于石油、煤炭、天然氣的第四大能源，也是其中唯一的可再生資源。我國年產(chǎn)秸稈6～8億 t，占世界總量的20%～30%[1-2]，但目前大部分秸稈仍被直接遺棄或田間焚燒，造成嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[3-4]。如能將秸稈進行適當處理，進而轉(zhuǎn)化為工業(yè)原料[5-7]或生物燃料[8-9]，不僅可以解決現(xiàn)有問題，還有望節(jié)約大量資源，極大地促進化工生產(chǎn)與環(huán)境保護之間的平衡。相比于傳統(tǒng)的物理[10-12]和化學方法[13-15]，生物法處理秸稈因操作簡單、成本較低、無二次污染等優(yōu)點，受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注[16]。放線菌是自然界木質(zhì)纖維素的主要分解者之一[17]，且兼具絲狀真菌對秸稈的瓦解破壞能力和細菌繁殖適應性強等特性[18]，但目前文獻報道的秸稈降解微生物仍以真菌、細菌及多菌種協(xié)同作用為主[19-21]，極少涉及放線菌。此外，放線菌已廣泛應用于抗生素、酶制劑、維生素和有機酸的生產(chǎn)，以及甾體轉(zhuǎn)化、烴類發(fā)酵、廢水處理等諸多方面[22-23]，對化工生產(chǎn)具有重要意義。 本研究運用循環(huán)流化技術(shù)，從土壤樣品中篩選出1株高效秸稈降解放線菌(命名為GC)。經(jīng)鑒定菌株GC為左式鏈霉菌，可在LB等基礎培養(yǎng)基中快速繁殖，并具有高產(chǎn)纖維素酶和降解木質(zhì)素的能力，采用GC單菌種處理小麥秸稈即可達到較為理想的降解效果。經(jīng)初步研究，除分泌纖維素酶和木質(zhì)素酶外，菌株GC可將秸稈轉(zhuǎn)化為多種石油烴、有機醇及植物甾醇。本研究為秸稈等農(nóng)業(yè)面源污染物的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤與秸稈 河北保定腐爛發(fā)黑秸稈和田間土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 無機鹽液體培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.0，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.2；纖維素液體培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0，NH4Cl 2.0，KH2PO44.0，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 0.3，蛋白胨 3.0，酵母粉 0.5，吐溫-80 0.2；木質(zhì)素液體培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.2，Na2HPO42.0，NaH2PO41.0，玉米粉20.0，大豆蛋白胨 20.0；LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0。高氏一號液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；無機鹽固體培養(yǎng)基：在無機鹽液體培養(yǎng)基的基礎上添加1%粉碎后的新鮮小麥秸稈和2%的瓊脂。培養(yǎng)基所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定 運用循環(huán)流化法篩選目標菌株[24]，將50 g部分自然腐爛小麥秸稈和200 g土壤放入流化床中，環(huán)流液為滅菌后的無機鹽液體培養(yǎng)基(2 L)。氣泵持續(xù)向流化床注入新鮮空氣，在蠕動泵的作用下環(huán)流液自下而上通過流化床并持續(xù)循環(huán)，調(diào)節(jié)氣泵和蠕動泵轉(zhuǎn)速使秸稈和土壤處于懸浮狀態(tài)。每2 d取5 mL環(huán)流液稀釋至10-2、10-4、10-6和10-8濃度，分別涂布于以小麥秸稈為唯一碳源的無機鹽固體培養(yǎng)基，初步判斷菌株是否具有秸稈降解能力。將長出的菌落分別在LB、PDA或高氏一號固體培養(yǎng)基中分離純化。純化后的菌株再分別通過剛果紅染色法進行復篩[25]，選取水解圈與菌落直徑比值較大的菌株繼續(xù)纖維素酶活測定，優(yōu)選出產(chǎn)酶活力較高的為目標菌株。菌株鑒定由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司完成。通過菌落PCR擴增測定細菌的16S rDNA序列，用MEGA 4構(gòu)建分子進化樹，采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion 模式建樹，用Bootstrap進行檢驗，并重復1 000次。

1.2.2 菌株生長特性 將菌株GC分別接種到LB和高氏一號液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)，定期取樣。將樣品在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，加入去離子水重懸，相同條件離心洗滌3次，保留離心得到的固體，冷凍干燥后稱重。

1.2.3 纖維素酶活測定[26]將菌株GC接種到纖維素液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液，根據(jù)酶活力大小適當稀釋1～2倍作為待測酶液。纖維素內(nèi)切(CMC)酶活和濾紙(FDA)酶活(濾紙酶活即總酶活)在底物CMC-Na(1%)和新華1號濾紙(50 mg)存在下用檸檬酸緩沖液(pH=5)測得。反應在50 ℃下進行30 min或1 h。產(chǎn)生還原糖的量由3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定。酶活單位(U)定義為在標準條件下每分鐘水解纖維素釋放1 μg葡萄糖所需的酶量 。

1.2.4 木質(zhì)素酶活測定 將菌株GC接種至木質(zhì)素液體培養(yǎng)基，發(fā)酵3 d后，經(jīng)離心取上清液為粗酶液。木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)測試方法參照文獻[27-29]。

1.2.5 秸稈降解失重率測定 將菌株GC接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。另取50 mL錐形瓶高溫烘干稱重(W1)。新鮮小麥秸稈研磨成2 mm左右的小段后，60 ℃烘干至恒重。稱取1 g左右烘干后的小麥秸稈(精確到0.1 mg，W2)，與含0.5%酵母粉的無機鹽液體培養(yǎng)基(質(zhì)量為小麥秸稈質(zhì)量的7.5倍)，一并加至50 mL錐形瓶中。121 ℃滅菌15 min后，接菌組接入GC菌懸液1 mL，空白對照組接入1 mL無菌水，30 ℃固態(tài)發(fā)酵處理20 d。滅菌后，烘干稱重，記為W3，每一條件設兩組平行。秸稈失重率(%)= ((W1+W2-W3)/W2)×100%。以接入1 mL無菌水的相同處理樣品為空白對照。

1.2.6 秸稈降解特性研究 ①菌體和秸稈表面結(jié)構(gòu)分析：將菌株GC液體培養(yǎng)3 d后離心，棄上清液，用0.1 mol/L PBS洗滌3次，經(jīng)戊二醛固定、乙醇梯度脫水干燥后，樣品噴金，用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。秸稈表面結(jié)構(gòu)分析時，固態(tài)發(fā)酵處理后的秸稈樣品高溫滅菌、烘干。以未經(jīng)處理的新鮮秸稈為空白對照，做相同處理，鍍金后進行電鏡觀察。②秸稈官能團變化分析：將固態(tài)發(fā)酵處理后的秸稈樣品高溫滅菌、烘干，以未經(jīng)處理的新鮮秸稈為空白對照，做相同處理，所得樣品粉碎研磨后用紅外光譜法(FT-IR)分析[30]。③木質(zhì)纖維素含量變化分析：將固態(tài)發(fā)酵處理后的秸稈樣品用72%的硫酸溶液洗滌，除去纖維素和半纖維素。不溶性的木質(zhì)素經(jīng)過濾、洗滌、烘干后稱重，計算剩余的木質(zhì)素含量。濾液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，計算纖維素和半纖維素含量。以未經(jīng)處理的新鮮秸稈作為空白對照，進行相同分析[31]。④秸稈降解產(chǎn)物分析：將固態(tài)發(fā)酵處理后的秸稈樣品用正丁醇回流提取，提取液用無水硫酸鈉脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，所得樣品經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

定期取循環(huán)流化床液體樣品涂布于以小麥秸稈為唯一碳源的無機鹽固體培養(yǎng)基，得到40株長勢良好的菌株。經(jīng)固體培養(yǎng)基分離純化和剛果紅染色法復篩，得到透明水解圈與菌落直徑比值較大的菌株繼續(xù)進行纖維素酶活測定，其中菌株GC所產(chǎn)纖維素酶活最高，纖維素內(nèi)切酶活和濾紙酶活分別可達67.57 U/mL和19.69 U/mL，選取GC為目標菌株。將GC液體培養(yǎng)成熟后，離心洗滌以獲得菌體，再經(jīng)戊二醛固定、乙醇洗脫干燥、樣品噴金后，通過掃描電鏡(SEM)觀察其菌體特征。如圖1所示，菌株GC具有典型的放線菌形態(tài)特征，菌絲為絲狀、鉤狀或螺旋狀，直徑小于1 μm。通過16S rDNA測序分析，菌株GC與Streptomycesdrozdowiczii的同源度為99%，初步鑒定為放線菌的左式鏈霉菌，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖1 菌株GC的SEM圖Fig.1 SEM images of the strain GC

2.2 菌株GC生長培養(yǎng)基的對比測試

將菌株GC分別接種于LB和高氏一號液體培養(yǎng)基，定期取樣、離心、凍干，測量細胞干重，結(jié)果見圖3。菌株GC在LB液體培養(yǎng)基中前期生長緩慢，8 h后迅速繁殖，8～10 h時可達到生長速率的最大值，48 h時干重最高可達0.25 g/100 mL，48 h后生長緩慢，并出現(xiàn)干重下降跡象，可能是由于生長條件惡化而發(fā)生菌體自溶。菌株GC在高氏一號液體培養(yǎng)基中的生長趨勢與在LB液體培養(yǎng)中基本相同，但生長速率更為緩慢，96 h時獲得干重的最大值，僅為0.19 g/100 mL。說明LB液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)更為豐富，更適于菌株GC的生長，所以后續(xù)實驗均采用LB培養(yǎng)基。

圖2 菌株GC的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of the strain GC

圖3 GC的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain GC

2.3 菌株GC纖維素酶活和木質(zhì)素酶活的測定

將菌株GC在纖維素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期取樣、離心，取上清液為粗酶液，測量其CMC酶活和FDA酶活，結(jié)果見圖4。CMC酶活在前10 h增長緩慢，10 h后快速增長，96 h時達到酶活最大值，為67.57 U/mL。 FDA酶活表達速率與CMC酶活類似，前期酶活較低，但后期迅速達到酶活最大值，在24～120 h范圍內(nèi)均穩(wěn)定在19.69 U/mL左右。對比圖3、圖4發(fā)現(xiàn)，菌株GC前期的纖維素酶活變化曲線與其生長曲線幾乎同趨勢變化，纖維素酶的產(chǎn)生與菌株生長密切相關(guān)，菌株生長產(chǎn)生纖維素酶，該酶又將纖維素降解產(chǎn)生的能量反過來提供給菌株生長。這與尹礎等[33]報道的結(jié)果基本一致，體現(xiàn)了菌株GC纖維素酶的產(chǎn)生為生長相關(guān)型。

圖4 纖維素內(nèi)切酶活和總酶活Fig.4 Cellulase endonuclease activity and total enzyme activity

木質(zhì)素的降解至少需要3種酶的參與，即木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。將菌株GC在木質(zhì)素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期取樣、離心，取上清液為粗酶液。粗酶液的Lip、MnP和Lac酶活最大值分別為0.042、0.095和0.02 U/mL。說明菌株GC不但能夠高效表達纖維素酶，還有一定的木質(zhì)素降解能力，可單獨用于秸稈的生物處理。Lima等[34]報道的Streptomycesdrozdowiczii菌株同樣具有一定的纖維素酶活性，但未發(fā)現(xiàn)其具有木質(zhì)素降解能力。

2.4 菌株GC對秸稈降解能力的測定

秸稈樣品經(jīng)固態(tài)發(fā)酵處理20 d后，高溫滅菌、烘干稱重，計算得到菌株GC處理后小麥秸稈的失重率為11.52 %，空白對照組的秸稈失重率均小于0.5%，說明菌株GC具有良好的單獨處理秸稈能力。將秸稈樣品用72%的硫酸溶液洗滌、過濾、烘干，分別將固體稱重，濾液經(jīng)HPLC分析，計算秸稈各組成的含量變化，結(jié)果見圖5。菌株GC處理后小麥秸稈的纖維素含量由原來的40.16%降至37.56%，半纖維素含量由原來的20.89%降至18.96%。木質(zhì)素的相對含量則由25.07%上升至27.41%，但絕對質(zhì)量仍減少了8.2 mg。說明菌株GC在處理秸稈過程中，主要通過所產(chǎn)纖維素酶將纖維素和半纖維素體外水解為葡萄糖，并在菌體內(nèi)被代謝利用，而對木質(zhì)素的利用率要低于纖維素。

圖5 秸稈處理前后各組分的含量變化Fig.5 The content of each component before and after the treatment of straw

秸稈處理前后的SEM觀察結(jié)果見圖6，其中未經(jīng)菌株GC處理的秸稈樣品(圖6a)，表面仍較為平滑、結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)菌株GC處理后秸稈樣品(圖6b)表面已參差不齊，結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞。說明菌株GC的木質(zhì)素利用率雖然相對較低，但對秸稈表面木質(zhì)素層的瓦解破壞能力在秸稈降解過程中起到十分重要的作用，這也是菌株GC能夠單獨處理秸稈的重要原因。

圖6 未經(jīng)GC處理秸稈(a)和經(jīng)GC處理秸稈(b)的SEM圖Fig.6 SEM images of GC-untreated straw (a) and GC-treated straw (b)

2.5 菌株GC處理后的秸稈官能團測定

采用FT-IR法分析菌株GC處理前后秸稈表面的官能團變化，結(jié)果見圖7。其峰位變化主要集中于500～910 cm-1和1 500～3 600 cm-1范圍內(nèi)。3 200～3 600 cm-1處代表羥基的伸縮振動，與醇類或酚類的形成有關(guān)。3 381 cm-1處吸收峰向3 386 cm-1處轉(zhuǎn)移，推測秸稈處理過程中可能有醇類物質(zhì)的形成。1 760～1 690 cm-1的吸收峰由C=O鍵的伸縮振動產(chǎn)生。1 732 cm-1吸收峰的消失，說明C=O發(fā)生重聚反應，形成了一些大分子次級產(chǎn)物。小于910 cm-1區(qū)域的吸收峰常與苯環(huán)的取代位置有關(guān)，667 cm-1處吸收峰由C-H鍵的彎曲振動產(chǎn)生，Chai等[35]認為該吸收峰的消失，代表長鏈烷烴的形成。

圖7 未經(jīng)GC處理(a)和經(jīng)GC處理(b)秸稈FT-IR圖Fig.7 FT-IR image of GC-untreated (a) and GC-treated straw (b)

2.6 菌株GC降解秸稈的產(chǎn)物測定

秸稈樣品經(jīng)有機溶劑反復抽提，對提取液進行GC-MS分析。由表1可以看出，GC處理后的產(chǎn)物中包含二十二烷(docosane)、二十三烷 (tricosane)、二十四烷(tetracosane)、三十一烷(hentriacontane)等多種石油烴組分，一種有機醇(2-丙基-1-戊醇(2-propyl-1-pentanol))，另外還有菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、谷甾醇(sitosterol)等多種植物甾醇，該結(jié)果與處理產(chǎn)物的紅外分析結(jié)果基本一致。上述產(chǎn)物中，既包括石油烴等被認為是不可再生的重要化工能源，還包括2-丙基-1-戊醇等難于合成的化工原料，以及具有較高市場價值的甾醇類保健品。如針對菌株GC的這一特征，對菌株GC發(fā)酵培養(yǎng)條件進行深入的優(yōu)化或?qū)闓C進行誘變處理，有望實現(xiàn)基于微生物發(fā)酵技術(shù)的秸稈等農(nóng)業(yè)面源污染物資源化利用。

表1 秸稈處理產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果Table 1 The analysis results of GC-MS of straw treated products

3 討 論

利用循環(huán)流化方法從土壤樣品中分離篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶的放線菌GC，經(jīng)16S rRNA鑒定該菌為左式鏈霉菌(Streptomycesdrozdowiczii)。菌株GC的纖維素酶活表達速率曲線與其生長曲線幾乎同趨勢變化，說明菌株GC纖維素酶的產(chǎn)生為生長相關(guān)型，并具有一定的木質(zhì)素降解能力。菌株GC固態(tài)處理小麥秸稈20 d后，秸稈的失重率可達11.52%，說明菌株GC具有良好的單獨處理小麥秸稈能力。菌株GC處理秸稈產(chǎn)物包含多種石油烴、有機醇和植物甾醇，說明其具有將秸稈等農(nóng)業(yè)面源污染物資源化利用的能力，但要形成具有競爭力的工業(yè)生產(chǎn)菌株，仍需要大量的深入研究。

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