苗麗娟,張立春, 張宏玲, 李青竹

(1.吉林農業(yè)科技學院 動物科技學院,吉林 吉林 132101；2.吉林省預防獸醫(yī)學重點實驗室,吉林 吉林 132101 )

乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)，可引起人畜共患的傳染病——流行性乙型腦炎，簡稱乙腦。JEV在分類上屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬成員[1-3]，病毒粒子呈球形，20面體對稱，有囊膜、單股、正鏈RNA。豬是乙腦重要的擴增宿主和儲存宿主，是乙腦病毒主要傳染源，臨床上以引起母豬發(fā)生繁殖障礙，公豬發(fā)生生育障礙為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失[4]。

本實驗室從吉林市郊區(qū)某豬場送檢病豬中分離到1株日本腦炎病毒，為后續(xù)的研究，尤其在分子病原學方面的差異研究奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

2016年6～7月，吉林某豬場送檢一例病豬，經主訴和病理剖檢后，初步診斷為疑似乙型腦炎病毒，采集病豬的淋巴結、睪丸和全血，混合研磨，取上清液，置于-20 ℃保存，用于基因的提取和病毒接種。

1.2 病毒接種

處理后的病料組織反復凍融三次后，然后以0.22 μm的濾器濾過上清液，按照10%比例接種于處于對數(shù)生長的平鋪瓶底的BHK21細胞，盲傳10代。

1.3 PCR檢測病毒

1.3.1 細胞培養(yǎng)物RNA提取及cDNA合成 將盲傳10代的細胞培養(yǎng)物取2份，按照實驗室常規(guī)方法進行RNA的提取并進行反轉錄，cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增與鑒定 按照PCR常規(guī)操作方法，進行PCR擴增，引物:P1：5'-AGTTGACATAGCTTGTGCAGG-3'，P2：5'-CACGACTGCCCATTCCCAGAC-3'，PCR的常規(guī)反應總體系為25 μL，其中2.5 μL 的10×buffer、 1 μL P1/P2( 20 pmol/μL)、2.5 μL dNTP(2.5 mmol/μL)、3 μL cDNA、 0.25 μL的 rTaq 酶、14.75 μL的滅菌水，反應條件： 94 ℃預變性5 min， 94 ℃ 30 s , 56.5 ℃ 45 s, 72 ℃ 30 s，72 ℃延伸10 min，25個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶。

1.4 免疫熒光試驗

采用96孔細胞培養(yǎng)板，將新分離株進行間接免疫熒光試驗，按照常規(guī)方法操作，一抗為購自中國藥品生物制品檢定所的乙型腦炎病毒的陽性血清，羊抗鼠的熒光二抗，熒光顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1 PCR 檢測結果

將盲傳10代的細胞培養(yǎng)物2份，經PCR 擴增， 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約550 bp處擴增出目的帶，與預測的大小相符，說明病毒分離成功，見圖1。

2.2 免疫熒光結果

新分離毒株接種BHK21細胞，熒光顯微鏡下觀察到其細胞漿內可見特異性熒光；而對照組細胞看不見，如圖2。

3 小 結

JEV作為人獸共患病受到很大的重視并積極預防，豬的感染比較普遍，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的急性傳染病之一。并且隨著生豬的飼養(yǎng)規(guī)模擴大，容易通過豬一蚊一豬的循環(huán)，造成病毒的傳播擴大。因為該病傳播的媒介是蚊，所以具有明顯的季節(jié)性。JEV也是我國已被證實的4種蟲媒病毒之一[5-7]，應該做好全年的防控措施，加強JEV的分離鑒定工作，客觀認識乙腦流行的規(guī)律。在20 世紀 40～50 年代間，國內的科研工作者已經分離出多株乙腦病毒，本試驗對患病豬臟器進行PCR檢測，確診為陽性后進行了BHK-21細胞接種，相對于動物培養(yǎng)分離病毒，細胞培養(yǎng)法操作簡單、接種量大、加速病毒分離過程、分離效果好等優(yōu)點，適宜于一般實驗室培養(yǎng)分離JEV，提高了病毒分離成功率。通過間接免疫熒光試驗鑒定，接毒的BHK-21細胞的胞漿內出現(xiàn)特異性熒光，確認分離的病毒株為JEV表明成功分離到1株乙腦病毒毒株，后續(xù)將進行全序列的分析、分型、變異趨勢改變等方面的研究。

圖1 PCR檢測細胞培養(yǎng)物Fig.1 Cell culture detected by PCR

圖2 免疫熒光試驗Fig.2 Immunofluorescence test

參考文獻：

[1] SOLOMON T,NI H L, DAVID W C，et al. Origin andEvolutionof JapaneseEncephalitisVirusin Southeast Asia[J].J Virol, 2003,77(5):3 091-3 098.

[2] 李曉宇,宋宏,付士紅,等. 中國流行性乙型腦炎病毒的分子生物學特性研究[J].病毒學報,2004 ,20(3):200-209.

[3] SANG IM YUN, SEOK YONG KIM, WOO YOUNG CHOI, et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitics viral strain K87P39[J].Virus Research, 2003, 96(1/2):129-140.

[4] 張麗穎.豬乙型腦炎病毒的分離鑒定、致弱及間接ELISA檢測方法的建立[D].南京: 南京農業(yè)大學，2011.

[5] 余永新, 武佩芬, 敖堅,等. 一株免疫性進一步提高的乙腦活疫苗減毒株的選育SA14-14-2 弱毒株某些生物學特性[J].中華微生物和免疫學雜志, 1981(1):77-84.

[6] 張永欣，符芳，李曦，等.中國東北地區(qū)3株日本腦炎病毒株的分離鑒定及基因分型[J].東北農業(yè)大學學報，2009，40(6):73-78.

[7] 王環(huán)宇,梁國棟. 我國蟲媒病毒研究10年回顧[J]. 中國公共衛(wèi)生,2003,19(4):473-476.