王 捷，耿果霞，楊 麗，徐德軍，陳華麗，茍清碧，裴一飛，吳 琳，李青旺*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

相比較于其他動物，豬精子質(zhì)膜含有豐富的不飽和脂肪酸和少量的膽固醇，使豬精子對冷凍刺激更為敏感[1]。大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會在冷凍過程中形成，以及預(yù)處理中精漿的移除，導(dǎo)致精子內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，質(zhì)膜受到破壞，失去了選擇通透性，冷凍解凍后精子活率顯著降低[2]。大量研究表明，外源性抗氧化劑的添加，可有效消除過量ROS，提高精子抗氧化損傷能力，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Giaretta等[3]發(fā)現(xiàn)，一定濃度的維生素C能提高豬解凍后精子活率和膜完整性。Jeong等[4]研究證明，在冷凍稀釋液中添加適量Vitamin E可以提高解凍后豬精子活率和功能完整性。Chanapiwat等[5]和Kaeoket等[6]一致認(rèn)為，添加適量L-半胱氨酸明顯改善解凍后精子質(zhì)量。Gadea等[7]研究表明，在冷凍稀釋液中添加適量還原型GSH可以明顯改善整體解凍后精子質(zhì)量，增強核蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高其體內(nèi)和體外的受精能力。Varo-Ghiuru等[8]在葉黃素對冷凍解凍后精子質(zhì)量的影響研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的葉黃素可以增強解凍后精子對滲透壓的耐受性，維持DNA雙鏈結(jié)構(gòu)并提高活率和頂體的完整性。盡管如此，仍然不能滿足實際生產(chǎn)需要，因此，尋找一些更有效的抗氧化劑，對提高優(yōu)良公畜利用率，加快豬精子冷凍保存研究，完善人工授精技術(shù)具有重要的意義。

芝麻酚(3，4-亞甲二氧基苯酚，sesamol,SM)是存在于芝麻油中的一種芳香類物質(zhì)，白色至淡黃色結(jié)晶性粉末或顆粒，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等極性有機溶劑，具有良好的藥理作用并常作為食品和醫(yī)藥的抗氧化劑。芝麻酚對OH·、NO、 O-·2等活性氧自由基均具有較強的清除作用[9-10]。芝麻酚被用于食品領(lǐng)域，多用來添加至植物或者動物油脂中，以提高油脂的抗氧化能力，延長油脂的保存時間[11]。但作為天然無毒的抗氧化劑，目前尚未發(fā)現(xiàn)芝麻酚對豬精子冷凍保存效果的研究。本試驗將不同濃度的芝麻酚作為外源性抗氧化劑添加到冷凍稀釋液中，通過檢測解凍后豬精子的活率、功能完整性和抗氧化能力，探究芝麻酚對豬精子冷凍保存效果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

精液樣品采集于楊凌某豬場，試驗豬為健康狀態(tài)良好，1～2歲齡杜洛克種公豬(n=3)。手握法采集豬精液，37 ℃顯微鏡下觀察，乳白色、無異味且活率大于75%的精液用于試驗。

1.2 方 法

1.2.1 預(yù)處理 用等溫等量BTS液稀釋檢驗合格的豬精液樣品，經(jīng)0.5 h平衡后離心(800 r/min,10 min,17 ℃)，棄上清液。用冷凍基礎(chǔ)液(Tris-Citric Acid Glucose,TCG)和卵黃以4∶1體積比配置成冷凍Ⅰ液，預(yù)冷后緩慢加入到離心后的沉積中，按1∶2比例稀釋，紗布包裹后放入4 ℃冰箱平衡1.5～2 h。再等體積緩慢加入預(yù)冷過的Ⅱ液(在冷凍Ⅰ液基礎(chǔ)上添加終濃度為3%的甘油)，并用紗布包裹后在4 ℃繼續(xù)平衡2～3 h。選擇精子活率高于0.6的精液樣品進(jìn)行冷凍。

1.2.2 冷凍 將裝有精液樣品并用封口粉密封好的0.25 mL細(xì)管放入程序冷凍儀中，以1 ℃/min的速率從4 ℃降至-5 ℃，當(dāng)溫度恒定在-5 ℃時，將細(xì)管置于液氮面3 cm上方熏蒸10 min，迅速投入到液氮中保存。

1.2.3 解凍 將細(xì)管從液氮中取出后迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋中孵育45 s，然后取出，剪斷兩端后將精液倒入1.5 mL離心管內(nèi)，置34 ℃恒溫水浴鍋中，10 min后進(jìn)行精液品質(zhì)檢測。

1.3 質(zhì)量檢測

1.3.1 活率 用等溫BTS液稀釋解凍精液樣品。400×倒置顯微鏡下觀察精子，根據(jù)其運動狀態(tài)評定精子活率。

1.3.2 線粒體活性 利用羅丹明( rhodamine123,Rh123)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)熒光染料聯(lián)合染色鑒別精子線粒體活性[12]。在熒光相差顯微鏡下(400×，激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長513 nm)觀察，計數(shù)頭部無紅色熒光且頸部發(fā)綠色熒光精子所占比率，重復(fù)3次，每次計數(shù)精子不少于200個。

1.3.3 精子質(zhì)膜完整性檢測 通過HOST試驗測定精子質(zhì)膜完整性[13]。精液樣品置于顯微鏡下(400×)觀察，計數(shù)具有彎尾的精子所占比率，重復(fù)3次，每次計數(shù)精子不少于200個。

1.3.4 頂體完整性 利用FITC-PNA熒光染色法檢測精子的頂體完整性[14]。在熒光相差顯微鏡下(400×，激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長530 nm)觀察，計數(shù)頭部頂端發(fā)綠色熒光精子所占比率，重復(fù)3次，每次計數(shù)精子不少于200個。

1.3.5 DNA完整性 利用吖啶橙染色法檢測精子DNA完整性[15]。在熒光相差顯微鏡下(400×下，激發(fā)光波長450 nm、發(fā)射光波長490 nm)觀察，計數(shù)頭部發(fā)綠色熒光精子所占比率，重復(fù)3次，每次計數(shù)精子不少于200個。

1.3.6 生化參數(shù) 取精液樣品離心(25 ℃, 1 600 r/min,5 min),在所得沉淀物中加入3倍體積1% TritonX-100抽提20 min，再次離心(25 ℃,4 000 r/min,30 min)，保留上清液，使用南京建成生物工程研究所的MDA、SOD、CAT和GSH-Px試劑盒，分別檢測解凍后豬精子MDA水平以及 SOD、CAT和GSH-PX酶的活力。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著。

1.5 試驗設(shè)計

分別向稀釋液中添加0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 g/L的芝麻酚，以不添加芝麻酚的TCG稀釋液作為對照，檢測解凍后豬精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體活性、DNA完整性、MDA水平和抗氧化酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻酚對解凍后豬精子活率和線粒體活性的影響

通過冷凍前添加一定濃度的芝麻酚，可以顯著提高解凍后豬精子活率和線粒體活性(P<0.05)，在0.1～0.2 g/L的范圍內(nèi)，芝麻酚濃度和解凍后精子的活率和線粒體活性呈正相關(guān)(P<0.05)，并且當(dāng)芝麻酚濃度為0.2 g/L時，精子活率和線粒體活率最高(P<0.05)，活率為45.84%，線粒體活性為56.87%。當(dāng)芝麻酚濃度為0.25 g/L時，解凍后精子活率顯著低于對照組(P<0.05)。添加0.05 g/L和0.25 g/L芝麻酚和對照組相比較，精子線粒體活性并沒有明顯改變(P>0.05)。

表1 芝麻酚對冷凍-解凍后豬精子活率和線粒體活性的影響Table 1 Effect of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa motility and mitochondrial activity

2.2 芝麻酚對解凍后豬精子功能完整性的影響

通過冷凍前添加一定濃度的芝麻酚，可以顯著提高解凍后精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚濃度為0.2 g/L時，精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率最高，相比較于對照組，分別提高了18.78%和14.09%(P<0.05)。但當(dāng)芝麻酚濃度為0.25 g/L時，精子DNA完整率最高，為72.46%(P<0.05)。芝麻酚添加濃度為0.05 g/L與對照組相比較，解凍后精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率和DNA完整率差異不顯著(P>0.05)。

2.3 芝麻酚對解凍后豬精子生化參數(shù)的影響

通過冷凍前添加一定濃度的芝麻酚，可以顯著提高解凍后精子SOD、CAT和GSH-Px活性(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.2 g/L時，MDA水平最低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性最高(P<0.05)，而當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.15 g/L時，CAT活性最高(P<0.05)。當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.05 g/L時，與對照組相比較差異不顯著(P>0.05)。因此，當(dāng)芝麻酚添加濃度為0.2 g/L時，對豬精子抗氧化性效果最佳。

表2 芝麻酚對冷凍-解凍后豬精子功能完整性的影響Table 2 Effect of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa functional integrity

表3 芝麻酚對冷凍-解凍后豬精子生化參數(shù)的影響Table 3 Effects of sesamol on frozen-thawed boar spermatozoa biochemical parameters

3 討 論

芝麻油中含有大量的PUFA，由于其內(nèi)活性物質(zhì)芝麻酚被認(rèn)為是芝麻油主要品質(zhì)穩(wěn)定劑，可以保護(hù)PUFA不被氧化，故芝麻油比其他植物油穩(wěn)定[16]。芝麻酚對O2-·自由基具有較強的清除作用，其清除活性要優(yōu)于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和維生素E[10]。作為天然的食源性抗氧化劑，芝麻酚已被廣泛研究于醫(yī)學(xué)損傷防護(hù)上。芝麻酚能保護(hù)小鼠外周血淋巴細(xì)胞的DNA，顯著降低因射線照射引起的DNA損傷[17]，提高小鼠淋巴細(xì)胞DNA的自我損傷修復(fù)能力[18]，通過改變氧化應(yīng)激水平和炎癥介質(zhì)一定程度上解除環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝毒性[19]。但是，目前還未報道關(guān)于芝麻酚對豬精液冷凍保護(hù)效果的研究。本試驗在冷凍稀釋液中添加梯度濃度的芝麻酚，表明適量濃度的芝麻酚對豬精子冷凍保護(hù)具有良好的作用。

豬精子因其質(zhì)膜富含PUFA，更易受到冷凍過程中產(chǎn)生的過量ROS的攻擊，而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷精子結(jié)構(gòu)，活率和受精能力降低[2]，因而豬精子對超低溫冷凍比較敏感。在冷凍稀釋劑中添加外源性抗氧化性劑可起到保護(hù)精子的作用，Varo-Ghiuru等[8]研究證明，水溶性維生素E能提高解凍后豬精子活率和頂體完整率。沈濤等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍稀釋液中添加α-硫辛酸，可以顯著提高解凍后豬精子活率和SOD酶活性。孫艷青等[21]研究證明，在豬精液冷凍稀釋液中添加葡萄籽原花青素，可以顯著提高解凍后精子品質(zhì)和抗氧化能力。本試驗中，在冷凍稀釋液中添加適量的芝麻酚，顯著提高解凍后精子質(zhì)量，本試驗研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致。

本試驗中，芝麻酚可提高解凍后豬精子質(zhì)量和抗氧化能力，表明芝麻酚對冷凍-解凍后豬精子有保護(hù)作用。芝麻酚是一種高效無毒的抗氧化劑，分子中含有可提供良好抗氧化能力的酚羥基和亞甲二氧基苯環(huán)，以及結(jié)構(gòu)中近似與苯環(huán)垂直的氧原子軌道使得整個分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[22]，其穩(wěn)定的抗氧化能力可以有效減少精子的氧化損傷，維持精子結(jié)構(gòu)和功能完整性。Kanimozhi等[23]驗證了芝麻酚可一定程度消除OH·、O2-、NO、DPPH·、ABTS·+等自由基。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映機體受過氧化的損傷程度，而SOD、CAT和GSH-Px酶活性均可直接反映精子抗氧化能力[24]。本試驗表明，芝麻酚可以提高精子內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性，Prasad等[25]研究表明，芝麻酚預(yù)處理體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞能提高SOD、CAT和GSH-Px活性，減輕γ射線的毒害作用、避免著絲粒發(fā)生畸變。當(dāng)添加芝麻酚濃度達(dá)到0.25 g/L時，解凍后精子質(zhì)量明顯下降，甚至低于對照組?？赡苁且驗樵谙♂屢褐刑砑痈邼舛鹊闹ヂ榉訒档途簶悠返膒H，從而對精子造成嚴(yán)重?fù)p害。pH可能通過影響乙酰輔酶A、琥珀酰輔酶A等一些代謝酶的酰化作用調(diào)節(jié)其活性進(jìn)而調(diào)節(jié)這些酶介導(dǎo)的能量代謝，影響ATP水平，從而影響體外培養(yǎng)精子活力及功能[26]。

有研究通過比較含有芝麻酚、Vitamin E和同時含有芝麻酚和Vitamin E的油在60 ℃放置時間不同得出結(jié)論，而含有芝麻酚和Vitamin E的油抗氧化活性較高[27]。將芝麻酚和生育酚配伍，對豬精液冷凍保存是否有更好的效果，還需進(jìn)一步試驗。

4 結(jié) 論

本試驗表明，豬精液冷凍稀釋液中添加適量的芝麻酚可以顯著提高解凍后精子活率、功能完整性和抗氧化活性，其最適添加濃度為0.2 g/L。

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