徐華榮，雒志新，李 托，王 昕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

ApoE (Apolipoprotein E)蛋白是人血漿中五類載脂蛋白之一，分為三個(gè)亞型[1-2]。有報(bào)道稱，ApoE基因的多態(tài)性與阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)的發(fā)生有關(guān)[3-6]。此外，ApoE蛋白被認(rèn)為參與了血管相關(guān)疾病病變過程[7-8]，但其具體的生物學(xué)功能目前并不清楚。類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)是一種組裝簡(jiǎn)單、定點(diǎn)敲除和細(xì)胞毒性低的基因敲除技術(shù)[9-10]，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于各類動(dòng)植物體的基因編輯中[11-13]。本試驗(yàn)構(gòu)建靶向敲除豬ApoE基因的TALEN，并在HEK293T細(xì)胞中利用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證其特異切割活性，為進(jìn)一步構(gòu)建豬疾病模型提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

T4 DNA連接酶及內(nèi)切酶BsmBI購(gòu)買于NEB，Taq DNA聚合酶購(gòu)自全式金生物公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自威格拉斯。載體pST-TALEN-Backbones、pmRFP-EGFP-MCS、TALEN模塊質(zhì)粒文庫(kù)，DH5α菌株，HEK293T細(xì)胞系均由本課題組保存。引物為上海博尚生物技術(shù)公司合成(表1)；載體序列測(cè)序由南京金思瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方 法

首先利用在線TAL Effector Nucleotide Targeter2.0工具[14]，在ApoE基因第四外顯子靶點(diǎn)位置左右各選擇一段TALE結(jié)合位點(diǎn)，然后采用本課題組先前報(bào)道的TALE組裝方法，利用TALE質(zhì)粒文庫(kù)組裝TALEN[15]，并進(jìn)一步利用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證其工作活性[16]。

1.2.1 TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建 利用TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0網(wǎng)站的TALN Targeter工具，在ApoE基因的第四外顯子靶位點(diǎn)的序列中，選擇推薦的TALE蛋白特異結(jié)合的序列。根據(jù)結(jié)合靶點(diǎn)位置的TALE蛋白氨基酸，選擇相應(yīng)的TALE四聯(lián)模塊，并采用PCR方法擴(kuò)增各個(gè)模塊(表1引物)。菌落PCR檢測(cè)陽性克隆(表1引物)，經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，獲得針對(duì)ApoE基因的TALEN真核表達(dá)載體PST-ApoE-Left和PST-ApoE-Right，-20 ℃保存。

1.2.2 報(bào)告載體構(gòu)建 報(bào)告引物經(jīng)95 ℃變性，65 ℃退火連接，獲得左右各帶NotI和BamHI酶切位點(diǎn)的粘性末端片段，psDRED骨架載體經(jīng)NotI和BamHI酶切后回收骨架片段，將兩者按照一定比例混合，T4連接酶16 ℃連接過夜。以CMV和報(bào)告載體的下游引物為上、下游引物，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)TALEN的活性 將HEK293T細(xì)胞接種在12孔板上培養(yǎng)，試驗(yàn)組將TALEN表達(dá)載體和對(duì)應(yīng)的報(bào)告載體混合共轉(zhuǎn)染，并設(shè)置轉(zhuǎn)染TALEN骨架載體和雙熒光報(bào)告載體的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染10 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。共轉(zhuǎn)24 h及48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞紅綠熒光的發(fā)光情況。

2 結(jié) 果

2.1 TALEN結(jié)合位點(diǎn)四聯(lián)模塊選擇及擴(kuò)增

通過https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen在ApoE基因第四外顯子靶點(diǎn)左右各選擇一段序列作為TALE結(jié)合位點(diǎn)(表2)。左側(cè)識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)為GGG CGC CGA CAT，右側(cè)為AGA GCA CCA AGC。在TALE質(zhì)粒文庫(kù)中選擇出對(duì)應(yīng)的模塊。

采用表1的引物將6個(gè)相應(yīng)的四聯(lián)模塊PCR擴(kuò)增，獲得引入BsmBI酶切位點(diǎn)的片段，取1 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，獲得465 bp左右的DNA條帶，TALE模塊擴(kuò)增完成。

2.2 ApoE-TALEN表達(dá)載體及雙熒光報(bào)告載體構(gòu)建

將ApoE-TALEN表達(dá)載體用NotI和EcoRI雙酶切消化獲得5 600 bp和 2 300 bp的目的片段(圖2，2、3號(hào)泳道)。陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證與模擬克隆序列相同，成功獲得ApoE-TALEN真核生物表達(dá)載體。報(bào)告載體經(jīng)測(cè)序檢測(cè)，目的片段序列正確。

表1 組裝TALEN四聯(lián)模塊、報(bào)告引物及測(cè)序引物序列表Table 1 Oligonucleotide sequences of primers for vector construction, detection and sequencing

表2 TALE四聯(lián)模塊的選擇Table 2 Tetramers of TALE

圖1 PCR擴(kuò)增四聯(lián)模塊 M. Trans2K Plus DNA Maker；1-3.模塊L1，L2，L3； 4-6模塊R1，R2，R3Fig.1 Amplified tetramers by PCR M. Trans2K Plus DNA Maker; 1-3. tetramers:L1，L2，L3；4-6. tetramers:R1，R2，R3

圖2 pST1374-TALEN-ApoE表達(dá)載體酶切鑒定 M. Trans 15K Marker；1. pST1374空白對(duì)照；2，3.陽性質(zhì)粒Fig.2 Digestion identification of pST1374-TALEN- ApoE expression vector M. Trans15K Marker; 1. pST1374 blank control; 2，3.positive plasmid

2.3 TALEN的活性檢測(cè)

ApoE-TALEN表達(dá)載體及雙熒光報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h及48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察。白光觀察細(xì)胞狀態(tài)，紅光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，綠光指示TALEN工作。在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h后，有較弱的熒光。48 h后，在試驗(yàn)組觀察到有綠色熒光表達(dá)，對(duì)照組沒有，說明TALEN能夠在真核細(xì)胞中工作(圖3)。

圖3 ApoE-TALEN雙熒光報(bào)告系統(tǒng)活性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The fluorescence results in HEK293T cells treated by TALEN

3 討 論

基因敲除是一種有效的研究基因功能的方法，可達(dá)到從根本上沉默靶基因的目的[17]。TALEN作為簡(jiǎn)單實(shí)用基因編輯技術(shù)，其基于Golden Gate優(yōu)化的組裝方法大大推動(dòng)了基因定點(diǎn)修飾的進(jìn)程。各種基于TALEN技術(shù)的動(dòng)植物突變體以及細(xì)胞突變系的報(bào)道不斷涌現(xiàn)，為生命科學(xué)研究提供了不可或缺的研究材料[18]。ApoE基因與各種衰老現(xiàn)象及心血管疾病發(fā)生相關(guān)，被認(rèn)為是潛在治療老年癡呆的靶基因[19]，但目前其具體的生物學(xué)功能并不清楚。

本研究利用本課題組快速高效組裝TALEN的方法一周內(nèi)完成了靶向ApoE基因的TALEN組裝，與組裝ZFNs相比極大縮短了試驗(yàn)周期[15]。并進(jìn)一步在HEK293T細(xì)胞中通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況指示TALEN的工作活性[16]。將TALEN的檢測(cè)結(jié)果與之前構(gòu)建的兩對(duì)ZFNs的結(jié)果做了比較，從綠色光斑的比例上來說，ZFN1的效率最高，其次是TALEN，而ZFN2的效率則最低[20]。造成這種結(jié)果的原因很可能是因?yàn)槿哌x擇的ApoE基因靶向位點(diǎn)不同的位置效應(yīng)，影響到了FokI的切割活性。當(dāng)然不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞狀態(tài)也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。多位點(diǎn)的靶向敲除為徹底的沉默基因功能提供了保障。由于豬在生理機(jī)能方面與人的高度相似性，因此利用豬作為疾病模型來研究ApoE的致病機(jī)理，具有重要的理論意義。

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