何旭，楊昆，胡銀山，徐孫秋，馬春蓉

(1川北醫(yī)學院第二臨床學院，四川南充637000；2南充市中心醫(yī)院)

急性淋巴細胞白血病(ALL)是以淋巴母細胞增生失調(diào)以及分化異常引起大量非成熟白細胞形成為特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占急性白血病的70%以上，是兒童白血病的常見類型[1,2]。隨醫(yī)療技術的快速發(fā)展，急性淋巴細胞白血病治愈率超過80%，顯著提高了患兒的生命質(zhì)量[3]。長期化療給患兒肝腎功能、血液及神經(jīng)系統(tǒng)等帶來嚴重的不良反應，患兒病死率較高[4]。從分子生物學角度探討急性淋巴細胞白血病發(fā)病機制，可為疾病的診斷、治療提供重要參考價值。微小RNA(miRNA)是新型非編碼小分子RNA，通過互補配對的方式特異性結合靶基因序列而介導細胞的增殖、分化等病理生理過程，miRNA還具有抑癌或者促癌作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)病過程密切相關[5,6]。miR150、miR155、miR233屬于miRNA家族，已有研究[7]表明其參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。目前關于miR150、miR155、miR233在急性淋巴細胞白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用相關報道較少。2015年3月～2018年3月，我們觀察了118例ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233的表達水平變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月～2018年3月我院血液科收治的118例急性淋巴細胞白血病患兒為觀察組。納入標準：①符合《兒童急性淋巴細胞性白血病診療建議》(第4次修訂草案)中關于ALL診斷標準[8]；②年齡≤14歲。排除標準：①T細胞、B細胞雜合ALL患兒；②合并有中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患兒；③合并其他可能影響本研究結果的疾病。根據(jù)疾病狀態(tài)將觀察組患兒分為初診者、緩解者、復發(fā)者。初診者32例，其中男18例，女14例；年齡4～13(9.2±0.9)歲；病理分型為T淋巴細胞白血病8例，B淋巴細胞白血病24例；危險度分型為低危型16例，中危型10例，高危型6例。緩解者46例，其中男26例，女20例；年齡3～14(8.9±1.2)歲；病理分型為T淋巴細胞白血病16例，B淋巴細胞白血病30例；危險度分型為低危型22例，中危型18例，高危型6例。復發(fā)者40例，其中男22例，女18例；年齡3～13(9.3±1.0)歲；病理分型為T淋巴細胞白血病18例，B淋巴細胞白血病22例；危險度分型為低危型20例，中危型12例，高危型8例。三者性別、年齡比較具有可比性(P均>0.05)。

隨機選取30例健康體檢兒童為對照組，其中男17例，女13例；年齡5～14(9.8±1.1)歲。觀察組、對照組患兒性別、年齡、病理分型及危險度分型比較，P均>0.05，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準，研究對象家屬在知情同意書上簽字。

1.2 血漿miR150、miR155、miR233檢測方法 采用qRT-PCR法檢測各組血漿miR150、miR155、miR233。抽取兩組兒童清晨空腹外周靜脈血5 mL，分離血漿，按照RNA提取試劑盒(海吉瑪制藥技術有限公司提供)上的說明提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒(美國Life Technologies公司提供)上的說明進行RNA的反轉錄。用Real-Time PCR分析儀(美國Life Technologies公司提供)行qRT-PCR，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。反應體系為20 μL，包括2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，All-in-One miRNA qPCR Primer 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。反應條件：95 ℃ 10 s預變性，95 ℃ 3 s變性，80 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，40個循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH，以2-△△Ct表示miR150、miR155、miR233的相對表達量。

2 結果

兩組兒童血漿miR150、miR155、miR233相對表達量見表1。與對照組比較，觀察組血漿miR150、miR233水平降低，miR155表達升高(P均<0.05)。與對照組比較，初診者、復發(fā)者血漿miR150、miR233水平降低，miR155水平升高(P均<0.05)；與緩解者比較，初診者、復發(fā)者血漿miR150、miR233水平降低，miR155水平升高(P均<0.05)。緩解者血漿miR150、miR155、miR233水平與對照組比較，P均>0.05。

表1 兩組兒童血漿miR150、miR155、miR233相對表達量比較

注：與對照組比較，※P<0.05；與緩解者比較，*P<0.05 。

初診ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233相對表達量與ALL臨床病理參數(shù)的關系見表2。不同性別、年齡及病理分型組患兒血漿miR150、miR155、miR233表達水平比較，P均>0.05；不同危險度分型患兒血漿miR150、miR155、miR233表達水平比較，P均<0.05，危險度分型越高，患兒血漿miR150、miR233表達水平越低，miR155表達水平越高。

表2 初診ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233相對表達量與ALL臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

ALL發(fā)病過程中癌基因激活以及抑癌基因失活是引起細胞發(fā)生癌變的病理學基礎。miRNA是由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，長度為19～25個核苷酸，它在人類病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，通過對調(diào)節(jié)信號分子而參與信號激活、細胞的增殖、分化、死亡等[9,10]。已有研究[11,12]表明，miRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，現(xiàn)已成為臨床輔助疾病診斷、治療及評估預后的重要標志物。

miR150是miRNA家族成員之一，通過對靶基因進行調(diào)控而導致下游基因異常表達，引起免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)紊亂，最終引起惡性腫瘤的發(fā)生[13]。研究[7]顯示，miR150在NK/T細胞淋巴瘤以及慢性粒細胞性白血病等惡性腫瘤中呈低水平表達，而在骨肉瘤、胃癌、慢性淋巴細胞性白血病等腫瘤中呈高水平表達。可見，不同類型惡性腫瘤中miR150作用不同。miR155是已知的致癌因子，通過在造血系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等惡性疾病中呈高表達水平而發(fā)揮致癌作用[14]。Faraoni 等[15]對急性髓性血病患者研究發(fā)現(xiàn)，患者血漿miR155表達明顯升高，可作用評估患者預后的重要指標。miR233在造血系統(tǒng)分化過程中通過表達上調(diào)而發(fā)揮重要生理功能，其表達異常則可引發(fā)血液系統(tǒng)惡性疾病。Han等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR233表達異常與兒童ALL預后密切相關，在初診期以及復發(fā)期患兒miR233表達下調(diào)，而在緩解期患兒中表達水平升高。

目前多數(shù)研究主要通過采集患者腫瘤組織或者骨髓的方式檢測miRNA，創(chuàng)傷較大，本研究觀察了急性淋巴細胞白血病患兒血漿中3種miRNA表達變化并探討其臨床意義。本研究結果顯示，觀察組患兒血漿miR150、miR233表達水平低于對照組，miRNA155表達水平高于對照組，提示血漿miR150、miR155、miR233異常表達可能參與了ALL的發(fā)病過程。進一步分析不同臨床病理參數(shù)的ALL患兒血漿miR150、miR155、miR233表達水平的差異，結果顯示初診、復發(fā)的患兒血漿中miR150、miR233表達下調(diào)，miR155表達上調(diào)，提示miR150和miR233可能發(fā)揮了抑癌基因的作用，而miR155發(fā)揮了促癌基因的作用。初診者與復發(fā)者、緩解者與對照組之間血漿miR150、miR155、miR233表達水平無差異。表明血漿miR150、miR155、miR233水平可反映ALL患兒不同的疾病狀態(tài)。此外，結果發(fā)現(xiàn)，血漿miR150、miR155、miR233表達水平與初診患兒的性別、年齡、病理分型與無關，而與危險度分型密切相關，病情危險程度越大，miR150、miR233表達水平越低，miR155表達水平越高，提示miR150、miR155、miR233可作為臨床評估急性淋巴細胞白血病危險程度和預后，從而為指導臨床制定個體化治療方案提供參考。

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