程光嘉，劉順林，朱國良，王金志

（1.奉化區(qū)人民醫(yī)院 老年科，浙江 寧波 315500；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215600；3.湖州市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 湖州 313000；4.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215007）

肺癌在中國是最常見的癌癥，也是中國癌癥死亡的主要原因。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，NSCLC包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌。盡管近年來對(duì)肺癌的診斷和治療不斷發(fā)展，但其5年生存率仍然很低。因此，我們急需一種或多種對(duì)肺癌診斷和判斷預(yù)后有效的分子標(biāo)志物。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方法。CpG島的異常DNA甲基化可能導(dǎo)致肺癌抑癌基因的失活，從而引起肺癌發(fā)生。由于DNA甲基化可能是肺癌最早期和最頻繁的改變，因此，越來越多的研究旨在評(píng)估某些基因啟動(dòng)子程度，以發(fā)現(xiàn)早期癌癥。Wnt信號(hào)通路組件與NSCLC的啟動(dòng)和發(fā)展有顯著關(guān)聯(lián)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzledrelated protein，SFRP）家族（SFRP1-SFRP5）和Wnt分子抑制因子-1（Wnt inhibitory factor1，WIF1）可通過直接與Wnt分子結(jié)合而抑制Wnt通路信號(hào)。SFRP1啟動(dòng)子甲基化已經(jīng)在包括肺癌在內(nèi)的許多腫瘤中被報(bào)道，而SFRP2和WIF1啟動(dòng)子甲基化也曾被報(bào)道通過Wnt信號(hào)通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。蛋白質(zhì)激酶C-B（protein kinase C-B，PRKCB）屬于蛋白質(zhì)激酶家族成員，其主要功能是參與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括Wnt信號(hào)通路的蛋白質(zhì)磷酸化。據(jù)報(bào)道，PRKCB在肺腺癌發(fā)展的早期階段即已發(fā)生甲基化，這表明其在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用[2]。

考慮到Wnt抑制劑在癌癥進(jìn)展和預(yù)后的重要作用，我們?cè)u(píng)估在Wnt信號(hào)通路中4種腫瘤抑制基因SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB啟動(dòng)子甲基化與NSCLC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相互關(guān)系，同時(shí)，研究其與NSCLC臨床病理因素之間的關(guān)系，以及結(jié)合這4種基因啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)能否為早期診斷NSCLC提供幫助。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2010年8月至2013年10月在湖州市第一人民醫(yī)院病理科存檔的111例肺癌組織標(biāo)本及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本（腺癌69例，鱗癌42例），其中男73例，女38例，平均年齡（63.1±10.2）歲。腫瘤的分期根據(jù)國際癌癥聯(lián)盟2009年TNM分期。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療與放療。所有參與患者均知情同意，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 石蠟包埋組織DNA的提取 挑選保存完好的石蠟切片，按照石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行全基因組DNA的提取。再通過NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度，檢測(cè)提取的DNA樣品。1.3 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 對(duì)于質(zhì)量達(dá)標(biāo)的基因組DNA采用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。此過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qua

ntitative methylation-specific PCR，qMSP） 甲基化引物分別與DNA甲基化、水、SYBR Green I染料混勻進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)基因的PCR反應(yīng)都有各自的反應(yīng)條件，為得到滿意的特異性的溶解曲線，需分別對(duì)每個(gè)基因的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。每例標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置陽性、陰性對(duì)照確保實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。熒光定量PCR過程在Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀中操作，甲基化水平用甲基化百分比參數(shù)（percentage of methylated reference，PMR）表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用兩樣本率的χ2檢驗(yàn)以及Fisher確切概率法，配對(duì)樣本甲基化率用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以癌旁組織為對(duì)照繪制ROC曲線，并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：AUC＜0.5時(shí)無診斷價(jià)值；AUC為0.5～0.7時(shí)準(zhǔn)確性較低；AUC為0.7～0.9時(shí)準(zhǔn)確性較高；AUC＞0.9時(shí)準(zhǔn)確性最高。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14種基因在NSCLC中甲基化水平SFRP1、SFRP2、

PRKCB和WIF1基因在肺癌組織中PMR分別為（11.23±4.67）%， （36.78±15.69）%， （24.57±6.89）%和（76.05±22.21）%，在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織則分別為（3.47±1.12）%， （16.76±6.87）%， （15.17±6.75）%和（58.76±18.75）%。結(jié)果顯示4種基因甲基化水平在肺癌組織明顯高于癌旁組織（見圖1）。臨床資料統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2在男性NSCLC患者中甲基化水平升高，而PRKCB和WIF1與年齡、性別、分化程度及有無吸煙等臨床特征無關(guān)（見表1）。

2.24種基因甲基化水平在NSCLC中的診斷價(jià)值 以癌旁組織為對(duì)照繪制ROC曲線，并計(jì)算AUC，SFRP1的AUC（95%CI）為0.711（0.642～0.780），診斷NSCLC的敏感性為62.2%，特異性為77.5%；SFRP2的AUC（95%CI）為0.631（0.577～0.704），診斷NSCLC的敏感性為47.7%，特異性為80.2%；PRKCB的AUC（95%CI）為0.650（0.578～0.721），其診斷NSCLC的敏感性為59.5%，特異性為68.5%；WIF1的AUC（95%CI）為0.573（0.498～0.648），特異性和敏感性均較低。但聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷NSCLC，AUC（95%CI）為0.747（0.683～0.811），診斷的敏感性為83.3%，特異性為96.0%；聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷肺腺癌，其AUC（95%CI）為0.798（0.724～0.871），其診斷的敏感性為88.4%，特異性為96.7%；聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷肺鱗癌，其AUC（95%CI）為0.728（0.620～0.837），其診斷的敏感性為90.6%，特異性為93.0%。見圖2。

圖1 SFRP1（A）、SFRP2（B）、PRKCB（C）、WIF1（D）在肺癌組織和相對(duì)應(yīng)癌旁組織中甲基化水平的比較

表1 聯(lián)合4種基因甲基化在肺癌中的診斷及其與臨床病理特征的關(guān)系[ M（P25，P75），%]

圖2 以癌旁組織為對(duì)照繪制ROC曲線

3 討論

當(dāng)前，對(duì)肺癌的診斷主要結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)以及組織病理學(xué)檢查[3]。然而，大多數(shù)患者的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)較遲，一旦出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)時(shí)，大多數(shù)患者預(yù)后往往不佳。表觀遺傳學(xué)的價(jià)值主要在于能夠早期發(fā)現(xiàn)腫瘤并對(duì)治愈腫瘤提供幫助。而異常甲基化在肺癌的早期階段即已發(fā)生作用，為早期診斷肺癌提供幫助[4]。表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物可用作為早期肺癌診斷的有效工具，而且具有非侵入性、高靈敏度和高特異性[5]。目前，傳統(tǒng)的血漿蛋白，例如細(xì)胞角蛋白19片段（cyfra211）、癌胚抗原（CEA）、特異性神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）作為腫瘤標(biāo)志物均缺乏足夠的靈敏度，診斷效率低[6]。

許多研究已經(jīng)在甲基化測(cè)試中進(jìn)行常規(guī)的MSP試驗(yàn)，然而，qMSP較傳統(tǒng)的MSP更為敏感，甲基化的改變?cè)谀[瘤的發(fā)生中是多樣化的。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)NSCLC標(biāo)本中存在單一基因的甲基化。此外，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，通過使用單個(gè)基因來研究甲基化水平，敏感性通常很低。因此，聯(lián)合研究一組基因的甲基化水平可以提高診斷NSCLC的敏感性。

Wnt信號(hào)通路的失調(diào)與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[7]。Wnt信號(hào)通路中抑制劑的超甲基化可以沉默抑癌基因從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本研究檢測(cè)4種候選基因的甲基化來預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

為了能夠評(píng)估這4種候選基因的診斷效率，本研究收集110例NSCLC組織標(biāo)本及其配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本，檢測(cè)SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB這4種基因甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)這4種基因在肺癌組織中表達(dá)較其相對(duì)的癌旁組織高；另外，從TCGA數(shù)據(jù)庫中817例NSCLC標(biāo)本和29例正常組織標(biāo)本的甲基化水平中發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB的AUC值分別是0.705、0.317、0.959和0.857，其中SFRP2的表達(dá)較低。DNA甲基化主要調(diào)節(jié)基因表達(dá)而且在腫瘤發(fā)生的早期階段，而單一的基因甲基化靈敏度相對(duì)較低，因此，結(jié)合多種基因甲基化水平可增加診斷肺癌的效率。

相關(guān)研究表明，SFRP1甲基化診斷皮膚鱗狀上皮癌[9]和食管鱗狀上皮細(xì)胞癌[10]具有一定價(jià)值，SFRP2甲基化診斷急性髓細(xì)胞白血病[11]、肝癌[12]、肺癌[1]具有一定價(jià)值。SFRP2甲基化之前報(bào)道主要 發(fā)生在女性、非吸煙的NSCLC患者[13]，這表明SFRP2甲基化在基因表達(dá)上具有性別效應(yīng)。但本研究表明SFRP1和SFRP2甲基化更常見于男性NSCLC患者。這種差異可能是由于不同的患病群體暴露于多重環(huán)境因素所致，因此NSCLC是一種多種性激素同時(shí)參與通路調(diào)節(jié)的異質(zhì)性疾病[14]。WIF1是Wnt信號(hào)通路中參與腫瘤發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子[15]，早期研究顯示，WIF1甲基化參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展[16]，本研究結(jié)果也提示了這一作用。PRKCB在人類乳腺癌中通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[17]，其過表達(dá)也發(fā)生在慢性淋巴細(xì)胞白血病中[18]。本研究表明，PRKCB啟動(dòng)子甲基化在肺癌組織中的表達(dá)較相對(duì)應(yīng)的癌旁組織高，這說明PRKCB甲基化水平對(duì)診斷NSCLC具有一定作用。

本研究的局限性主要包括缺乏在體液中發(fā)現(xiàn)甲基化以及不能預(yù)測(cè)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)之間是否存在聯(lián)系。然而，Wnt通路抑制劑基因的甲基化狀態(tài)可能是預(yù)測(cè)NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

總的來說，啟動(dòng)子甲基化，對(duì)于一組Wnt信號(hào)通路基因（SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB），有可能被用作NSCLC早期診斷的生物標(biāo)志物。

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