程光嘉，劉順林，朱國良，王金志

（1.奉化區(qū)人民醫(yī)院 老年科，浙江 寧波 315500；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215600；3.湖州市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 湖州 313000；4.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215007）

肺癌在中國是最常見的癌癥，也是中國癌癥死亡的主要原因。肺癌可分為非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，NSCLC包括腺癌、鱗癌和大細胞肺癌。盡管近年來對肺癌的診斷和治療不斷發(fā)展，但其5年生存率仍然很低。因此，我們急需一種或多種對肺癌診斷和判斷預(yù)后有效的分子標志物。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方法。CpG島的異常DNA甲基化可能導(dǎo)致肺癌抑癌基因的失活，從而引起肺癌發(fā)生。由于DNA甲基化可能是肺癌最早期和最頻繁的改變，因此，越來越多的研究旨在評估某些基因啟動子程度，以發(fā)現(xiàn)早期癌癥。Wnt信號通路組件與NSCLC的啟動和發(fā)展有顯著關(guān)聯(lián)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzledrelated protein，SFRP）家族（SFRP1-SFRP5）和Wnt分子抑制因子-1（Wnt inhibitory factor1，WIF1）可通過直接與Wnt分子結(jié)合而抑制Wnt通路信號。SFRP1啟動子甲基化已經(jīng)在包括肺癌在內(nèi)的許多腫瘤中被報道，而SFRP2和WIF1啟動子甲基化也曾被報道通過Wnt信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。蛋白質(zhì)激酶C-B（protein kinase C-B，PRKCB）屬于蛋白質(zhì)激酶家族成員，其主要功能是參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括Wnt信號通路的蛋白質(zhì)磷酸化。據(jù)報道，PRKCB在肺腺癌發(fā)展的早期階段即已發(fā)生甲基化，這表明其在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用[2]。

考慮到Wnt抑制劑在癌癥進展和預(yù)后的重要作用，我們評估在Wnt信號通路中4種腫瘤抑制基因SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB啟動子甲基化與NSCLC發(fā)生風(fēng)險的相互關(guān)系，同時，研究其與NSCLC臨床病理因素之間的關(guān)系，以及結(jié)合這4種基因啟動子甲基化水平檢測能否為早期診斷NSCLC提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2010年8月至2013年10月在湖州市第一人民醫(yī)院病理科存檔的111例肺癌組織標本及相對應(yīng)的癌旁組織標本（腺癌69例，鱗癌42例），其中男73例，女38例，平均年齡（63.1±10.2）歲。腫瘤的分期根據(jù)國際癌癥聯(lián)盟2009年TNM分期。所有患者術(shù)前均未進行化療與放療。所有參與患者均知情同意，并獲得本院倫理委員會批準通過。

1.2 石蠟包埋組織DNA的提取 挑選保存完好的石蠟切片，按照石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說明書進行全基因組DNA的提取。再通過NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度，檢測提取的DNA樣品。1.3 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 對于質(zhì)量達標的基因組DNA采用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化實驗。此過程嚴格按照說明書進行操作。

1.4 熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈式反應(yīng)（qua

ntitative methylation-specific PCR，qMSP） 甲基化引物分別與DNA甲基化、水、SYBR Green I染料混勻進行熒光定量PCR擴增。每個基因的PCR反應(yīng)都有各自的反應(yīng)條件，為得到滿意的特異性的溶解曲線，需分別對每個基因的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。每例標本設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)置陽性、陰性對照確保實驗的可靠性和準確性。熒光定量PCR過程在Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀中操作，甲基化水平用甲基化百分比參數(shù)（percentage of methylated reference，PMR）表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。采用兩樣本率的χ2檢驗以及Fisher確切概率法，配對樣本甲基化率用配對樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。以癌旁組織為對照繪制ROC曲線，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。判斷標準：AUC＜0.5時無診斷價值；AUC為0.5～0.7時準確性較低；AUC為0.7～0.9時準確性較高；AUC＞0.9時準確性最高。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14種基因在NSCLC中甲基化水平SFRP1、SFRP2、

PRKCB和WIF1基因在肺癌組織中PMR分別為（11.23±4.67）%， （36.78±15.69）%， （24.57±6.89）%和（76.05±22.21）%，在相對應(yīng)的癌旁組織則分別為（3.47±1.12）%， （16.76±6.87）%， （15.17±6.75）%和（58.76±18.75）%。結(jié)果顯示4種基因甲基化水平在肺癌組織明顯高于癌旁組織（見圖1）。臨床資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2在男性NSCLC患者中甲基化水平升高，而PRKCB和WIF1與年齡、性別、分化程度及有無吸煙等臨床特征無關(guān)（見表1）。

2.24種基因甲基化水平在NSCLC中的診斷價值 以癌旁組織為對照繪制ROC曲線，并計算AUC，SFRP1的AUC（95%CI）為0.711（0.642～0.780），診斷NSCLC的敏感性為62.2%，特異性為77.5%；SFRP2的AUC（95%CI）為0.631（0.577～0.704），診斷NSCLC的敏感性為47.7%，特異性為80.2%；PRKCB的AUC（95%CI）為0.650（0.578～0.721），其診斷NSCLC的敏感性為59.5%，特異性為68.5%；WIF1的AUC（95%CI）為0.573（0.498～0.648），特異性和敏感性均較低。但聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷NSCLC，AUC（95%CI）為0.747（0.683～0.811），診斷的敏感性為83.3%，特異性為96.0%；聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷肺腺癌，其AUC（95%CI）為0.798（0.724～0.871），其診斷的敏感性為88.4%，特異性為96.7%；聯(lián)合這4種基因甲基化水平診斷肺鱗癌，其AUC（95%CI）為0.728（0.620～0.837），其診斷的敏感性為90.6%，特異性為93.0%。見圖2。

圖1 SFRP1（A）、SFRP2（B）、PRKCB（C）、WIF1（D）在肺癌組織和相對應(yīng)癌旁組織中甲基化水平的比較

表1 聯(lián)合4種基因甲基化在肺癌中的診斷及其與臨床病理特征的關(guān)系[ M（P25，P75），%]

圖2 以癌旁組織為對照繪制ROC曲線

3 討論

當(dāng)前，對肺癌的診斷主要結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)以及組織病理學(xué)檢查[3]。然而，大多數(shù)患者的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)較遲，一旦出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)時，大多數(shù)患者預(yù)后往往不佳。表觀遺傳學(xué)的價值主要在于能夠早期發(fā)現(xiàn)腫瘤并對治愈腫瘤提供幫助。而異常甲基化在肺癌的早期階段即已發(fā)生作用，為早期診斷肺癌提供幫助[4]。表觀遺傳學(xué)生物標志物可用作為早期肺癌診斷的有效工具，而且具有非侵入性、高靈敏度和高特異性[5]。目前，傳統(tǒng)的血漿蛋白，例如細胞角蛋白19片段（cyfra211）、癌胚抗原（CEA）、特異性神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）作為腫瘤標志物均缺乏足夠的靈敏度，診斷效率低[6]。

許多研究已經(jīng)在甲基化測試中進行常規(guī)的MSP試驗，然而，qMSP較傳統(tǒng)的MSP更為敏感，甲基化的改變在腫瘤的發(fā)生中是多樣化的。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)在每一個NSCLC標本中存在單一基因的甲基化。此外，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，通過使用單個基因來研究甲基化水平，敏感性通常很低。因此，聯(lián)合研究一組基因的甲基化水平可以提高診斷NSCLC的敏感性。

Wnt信號通路的失調(diào)與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[7]。Wnt信號通路中抑制劑的超甲基化可以沉默抑癌基因從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本研究檢測4種候選基因的甲基化來預(yù)測腫瘤的發(fā)生風(fēng)險。

為了能夠評估這4種候選基因的診斷效率，本研究收集110例NSCLC組織標本及其配對的癌旁組織標本，檢測SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB這4種基因甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)這4種基因在肺癌組織中表達較其相對的癌旁組織高；另外，從TCGA數(shù)據(jù)庫中817例NSCLC標本和29例正常組織標本的甲基化水平中發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB的AUC值分別是0.705、0.317、0.959和0.857，其中SFRP2的表達較低。DNA甲基化主要調(diào)節(jié)基因表達而且在腫瘤發(fā)生的早期階段，而單一的基因甲基化靈敏度相對較低，因此，結(jié)合多種基因甲基化水平可增加診斷肺癌的效率。

相關(guān)研究表明，SFRP1甲基化診斷皮膚鱗狀上皮癌[9]和食管鱗狀上皮細胞癌[10]具有一定價值，SFRP2甲基化診斷急性髓細胞白血病[11]、肝癌[12]、肺癌[1]具有一定價值。SFRP2甲基化之前報道主要 發(fā)生在女性、非吸煙的NSCLC患者[13]，這表明SFRP2甲基化在基因表達上具有性別效應(yīng)。但本研究表明SFRP1和SFRP2甲基化更常見于男性NSCLC患者。這種差異可能是由于不同的患病群體暴露于多重環(huán)境因素所致，因此NSCLC是一種多種性激素同時參與通路調(diào)節(jié)的異質(zhì)性疾病[14]。WIF1是Wnt信號通路中參與腫瘤發(fā)生的負調(diào)控因子[15]，早期研究顯示，WIF1甲基化參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展[16]，本研究結(jié)果也提示了這一作用。PRKCB在人類乳腺癌中通過上調(diào)細胞周期蛋白D1影響細胞增殖和細胞周期來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[17]，其過表達也發(fā)生在慢性淋巴細胞白血病中[18]。本研究表明，PRKCB啟動子甲基化在肺癌組織中的表達較相對應(yīng)的癌旁組織高，這說明PRKCB甲基化水平對診斷NSCLC具有一定作用。

本研究的局限性主要包括缺乏在體液中發(fā)現(xiàn)甲基化以及不能預(yù)測甲基化狀態(tài)與基因表達之間是否存在聯(lián)系。然而，Wnt通路抑制劑基因的甲基化狀態(tài)可能是預(yù)測NSCLC風(fēng)險的一個有價值的生物標志物。

總的來說，啟動子甲基化，對于一組Wnt信號通路基因（SFRP1、SFRP2、WIF1、PRKCB），有可能被用作NSCLC早期診斷的生物標志物。

[1] XIE J, ZHANG Y, HU X, et al. Norcantharidin inhibits Wnt signal pathway via promoter demethylation of WIF-1 in human non-small cell lung cancer[J]. Med Oncol, 2015, 32(5):145.

[2] LEE S H, CHEN T, ZHOU J, et al. Protein kinase C-beta gene variants, pathway activation, and enzastaurin activity in lung cancer[J]. Clin Lung Cancer, 2010, 11(3): 169-175.

[3] ANGLIM P P, ALONZO T A, LAIRD-OFFRINGA I A.DNA methylation-based biomarkers for early detection of non-small cell lung cancer: An update[J]. Mol Cancer, 2008,7: 81.

[4] DI P A, DEL R M, PETRINI I, et al. Recent advances in epigenomics in NSCLC: real-time detection and therapeutic implications[J]. Epigenomics, 2016, 8(8): 1151-1167.

[5] MEHTA A, DOBERSCH S, ROMERO-OLMEDO A J, et al.Epigenetics in lung cancer diagnosis and therapy[J]. Cancer Metastasis Rev, 2015, 34(2): 229-241.

[6] SCHNEIDER J, PHILIPP M, VELCOVSKY H G, et al. Progastrin-releasing peptide (ProGRP), neuron specif i c enolase(NSE), carcinoembryonic antigen (CEA) and cytokeratin 19-fragments (CYFRA 21-1) in patients with lung cancer in comparison to other lung diseases[J]. Anticancer Res, 2003,23(2A): 885-893.

[7] REYA T, CLEVERS H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature, 2005, 434(7035): 843-850.

[8] YU J, TAO Q, CHENG Y Y, et al. Promoter methylation of the Wnt/beta-catenin signaling antagonist Dkk-3 is associated with poor survival in gastric cancer[J]. Cancer, 2009, 115(7): 49-60.

[9] LIANG J, KANG X, HALIFU Y, et al. Secreted frizzled-related protein promotors are hypermethylated in cutaneous squamous carcinoma compared with normal epidermis[J].BMC Cancer, 2015, 15: 641.

[10] LIU J B, QIANG F L, DONG J, et al. Plasma DNA methylation of Wnt antagonists predicts recurrence of esophageal squamous cell carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2011,17(44): 4917-4921.

[11] GHASEMI A, ROSTAMI S, CHAHARDOULI B, et al.Study of SFRP1 and SFRP2 methylation status in patients with de novo acute myeloblastic leukemia[J]. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 2015, 9(1): 15-21.

[12] KOHNO H, AMATYA V J, TAKESHIMA Y, et al. Aberrant promoter methylation of WIF-1 and SFRP1, 2, 4 genes in mesothelioma[J]. Oncol Rep, 2010, 24(2): 423-431.

[13] SUZUKI M, SHIGEMATSU H, NAKAJIMA T, et al. Synchronous alterations of Wnt and epidermal growth factor receptor signaling pathways through aberrant methylation and mutation in non small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2007, 13(20): 6087-6092.

[14] BERARDI R, MORGESE F, SANTINELLI A, et al. Hormonal receptors in lung adenocarcinoma: expression and difference in outcome by sex[J]. Oncotarget, 2016, 7(50):82648-82657.

[15] LEE S M, PARK J Y, KIM D S. Wif1 hypermethylation as unfavorable prognosis of non-small cell lung cancers with EGFR mutation[J]. Mol Cells, 2013, 36(1): 69-73.

[16] HUANG T, CHEN X, HONG Q, et al. Meta-analyses of gene methylation and smoking behavior in non-small cell lung cancer patients[J]. Sci Rep, 2015, 5: 8897.

[17] LI H, WEINSTEIN I B. Protein kinase C beta enhances growth and expression of cyclin D1 in human breast cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(23): 11399-11408.

[18] ABRAMS S T, LAKUM T, LIN K, et al. B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia cells is regulated by overexpressed active protein kinase CbetaII[J]. Blood, 2007,109(3): 1193-1201.