蔣偉青，袁欣，劉晨，任瀟，王永剛

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）病理學(xué)特點表現(xiàn)為腦內(nèi)淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1]。淀粉樣斑塊由β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積所形成，而Aβ由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)過蛋白水解作用而產(chǎn)生，APP代謝異常會導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生和清除失衡而導(dǎo)致Aβ過度沉積[2-3]。凋亡參與許多神經(jīng)退行性疾病如AD的神經(jīng)元死亡過程[4]。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的重要成員之一，在抑制凋亡和調(diào)控細胞分裂中起重要作用[4]。本研究探討survivin對APP代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 原代大鼠海馬神經(jīng)元、PC12細胞購自上海賽傲公司。survivin抗體、APP抗體及GAPDH內(nèi)參抗體購自英國Abcam公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光技術(shù)：細胞爬片用PBS浸洗后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗后，0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗后用山羊血清室溫封閉30 min，4 ℃孵育一抗過夜，PBST浸洗后，室溫避光孵育熒光二抗，PBST浸洗后，封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞接種到6孔板。次日，吸盡培養(yǎng)基，用Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細胞2次。對于每孔細胞，用200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋空載體1 μg、HA-APP質(zhì)粒1 μg、HAAPP質(zhì)粒和GFP-survivin質(zhì)粒[5]各1 μg，混勻放置10 min后將Lipofectamine 2000與質(zhì)?；旌?，混勻后室溫放置25 min，加入到6孔板的細胞中推勻，將培養(yǎng)板放入37 ℃孵育，轉(zhuǎn)染48 h后進行蛋白提取或凋亡染料染色。

1.2.3 Western blot：利用CockTail/RIPA（1∶100）裂解細胞提取總蛋白，測定蛋白濃度后定量加樣進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后用5% BSA于室溫慢搖封閉2 h，TBST洗滌后，4 ℃搖孵育一抗（5% BSA稀釋）過夜，TBST洗滌后，室溫慢搖孵育HRP二抗（5%BSA稀釋）2 h，TBST洗滌后進行壓片顯影。

1.2.4 流式細胞儀檢測：凋亡染色利用細胞凋亡檢測試劑盒，PI和Annexin V染色后進行流式細胞儀分析，利用CellQuest軟件對結(jié)果進行分析、繪制散點圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色結(jié)果 通過免疫熒光染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)survivin與APP可以共存。這一結(jié)果提供了survivin在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)APP代謝的形態(tài)學(xué)證據(jù)（見圖1）。

圖1 大鼠海馬神經(jīng)元survivin與APP免疫熒光染色結(jié)果（×63）

2.2 Western blot檢測結(jié)果 將構(gòu)建好的HA-APP質(zhì)粒分別單轉(zhuǎn)染或者與GFP-survivin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染具有神經(jīng)元反應(yīng)性的PC12細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細胞，通過Western blot檢測APP在PC12細胞內(nèi)的表達。結(jié)果顯示，APP和survivin共轉(zhuǎn)染組與APP單轉(zhuǎn)染組比，APP表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。這表明survivin可以抑制APP在PC12細胞內(nèi)的表達。

2.3 流式細胞儀檢測結(jié)果 將APP單轉(zhuǎn)染與APP和survivin共轉(zhuǎn)染PC12細胞用凋亡染料PI和Annexin V染色后，經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，APP單轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了大量的細胞凋亡，APP和survivin共轉(zhuǎn)染后凋亡率明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。表明APP過量表達可以誘發(fā)細胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細胞凋亡。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)survivin與APP可以共存，survivin可以抑制APP在PC12細胞內(nèi)的表達，APP過量表達可以誘發(fā)細胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細胞凋亡。

凋亡是許多神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡過程的重要參與因素[4]。雖然一些臨床和亞臨床的研究已經(jīng)報道IAP的神經(jīng)保護作用，但是它們的臨床益處尚不清楚。Survivin在胚胎組織及有細胞增殖的組織均有表達[6-7]，且在炎癥組織[8]、創(chuàng)傷性腦損傷[9-10]和腫瘤組織[11-13]中有過表達。通過操縱survivin來抑制凋亡和調(diào)控有絲分裂從而達到神經(jīng)元的保護作用，因此可在神經(jīng)修復(fù)和保護中得以利用。細胞實驗已證明survivin基因（桿狀病毒IAP重復(fù)序列）突變體對分化后神經(jīng)細胞具有促進分裂和增殖的作用[14]，另有動物研究報道，在腦損傷后，survivin參與調(diào)節(jié)成年小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)前體細胞活性并抑制神經(jīng)元凋亡或程序性死亡[15]。另外，已有不同survivin突變體用于腫瘤治療的研究[16]，借鑒類似的方法，有助于開拓對神經(jīng)退行性

疾病治療的新思路。

圖2 Survivin抑制APP在PC12細胞內(nèi)的表達

圖3 Survivin抑制APP誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡

APP是APP家族蛋白成員之一，不同的酶促作用使其產(chǎn)生具有不同生理作用的衍生物。APP參與引起癡呆的最常見的退行性疾病，即AD的病理生理過程。另外，有報導(dǎo)發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征的患者中APP表達升高。因此，研究參與調(diào)控APP代謝的機制對相關(guān)疾病的治療研究具有一定價值[17]。目前關(guān)于AD的病理生理解釋包括膽堿能假說、Aβ假說、tau蛋白假說和免疫假說[18]。其中主流的Aβ假說認為，APP代謝異常會導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生和清除失衡而導(dǎo)致Aβ過度沉積[2-3]。目前臨床上對于AD的治療策略包括乙酰膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑[19]，對于AD治療策略的研究方向主要以Aβ和tau蛋白為靶點[18，20]。雖然目前尚未有利用survivin達到AD治療效果的報導(dǎo)，但是，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，予轉(zhuǎn)基因AD小鼠亞硒酸鈉飲食，可上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路并反式激活包括survivin在內(nèi)的基因表達，同時可減少APP磷酸化從而減少APP裂解和Aβ形成[21]，表明survivin在調(diào)節(jié)APP代謝中的潛在作用。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin可以抑制APP在細胞內(nèi)的表達，同時survivin可以抑制APP過表達所引起的細胞凋亡。本研究結(jié)果對未來suivivin參與AD治療方面的研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

[1] KUMAR A, SINGH A, EKAVALI. A review on Alzheimer’s disease pathophysiology and its management: an update[J].Pharmacol Rep, 2015, 67(2): 195-203.

[2] SALOMONE S, CARACI F, LEGGIO G M, et al. New pharmacological strategies for treatment of Alzheimer’s disease: focus on disease modifying drugs[J]. Br J Clin Pharmacol, 2012, 73(4): 504-517.

[3] SCHENK D, BARBOUR R, DUNN W, et al. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse[J]. Nature, 1999, 400(6740): 173-177.

[4] BARATCHI S, KANWAR R K, KANWAR J R. Survivin:a target from brain cancer to neurodegenerative disease[J].Crit Rev Biochem Mol Biol, 2010, 45(6): 535-554.

[5] YAO L L, WANG Y G, CAI W J, et al. Survivin mediates the anti-apoptotic effect of delta-opioid receptor stimulation in cardiomyocytes[J]. J Cell Sci, 2007, 120(Pt 5): 895-907.

[6] 王會恩, 谷建琦. 生存素研究進展[J]. 中國醫(yī)療前沿, 2011,6(12): 13, 40.

[7] KOBAYASHI K, HATANO M, OTAKI M, et al. Expression of a murine homologue of the inhibitor of apoptosis protein is related to cell proliferation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1999, 96(4): 1457-1462.

[8] TUMES D J, CONNOLLY A, DENT L A. Expression of survivin in lung eosinophils is associated with pathology in a mouse model of allergic asthma[J]. Int Immunol, 2009, 21(6): 633-644.

[9] JOHNSON E A, SVETLOV S I, WANG K K, et al. Cellspecific DNA fragmentation may be attenuated by a survivin-dependent mechanism after traumatic brain injury in rats[J]. Exp Brain Res, 2005, 167(1): 17-26.

[10] OZISIK K, OZISIK P, YILDIRIM E, et al. Expression of antiapoptotic survivin and aven genes in rat heart tissue after traumatic brain injury[J]. Transplant Proc, 2006, 38(9):2784-2787.

[11] KANWAR J R, SHEN W P, KANWAR R K, et al. Effects of survivin antagonists on growth of established tumors and B7-1 immunogene therapy[J]. J Natl Cancer Inst, 2001, 93(20): 1541-1552.

[12] SHI Z, LIANG Y J, CHEN Z S, et al. Overexpression of Survivin and XIAP in MDR cancer cells unrelated to P-glycoprotein[J]. Oncol Rep, 2007, 17(4): 969-976.

[13] 金曉昇, 安慧敏, 黃智銘. 生存素和P T E N在良惡性胃潰瘍中的表達[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2017, 47(6): 456-458.

[14] BARATCHI S, KANWAR R K, CHEUNG C H, et al. Proliferative and protective effects of SurR9-C84A on differentiated neural cells[J]. J Neuroimmunol, 2010, 227(1-2): 120-132.

[15] ZHANG Z, WANG H, JIN Z, et al. Downregulation of survivin regulates adult hippocampal neurogenesis and apoptosis, and inhibits spatial learning and memory following traumatic brain injury[J]. Neuroscience, 2015, 300: 219-228.

[16] YAN H, THOMAS J, LIU T, et al. Induction of melanoma cell apoptosis and inhibition of tumor growth using a cellpermeable Survivin antagonist[J]. Oncogene, 2006, 25(52):6968-6974.

[17] CORONEL R, BERNABEU-ZORNOZA A, PALMER C,et al. Role of amyloid precursor protein (APP) and its derivatives in the biology and cell fate specif i cation of neural stem cells[J]. Mol Neurobiol, 2018 .

[18] KURZ A, PERNECZKY R. Novel insights for the treatment of Alzheimer’s disease[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2011, 35(2): 373-379.

[19] SILVESTRELLI G, LANARI A, PARNETTI L, et al. Treatment of Alzheimer’s disease: from pharmacology to a better understanding of disease pathophysiology[J]. Mech Ageing Dev, 2006, 127(2): 148-157.

[20] ANAND R, GILL K D, MAHDI A A. Therapeutics of Alzheimer’s disease: Past, present and future[J]. Neuropharmacology, 2014, 76 Pt A: 27-50.

[21] JIN N, ZHU H, LIANG X, et al. Sodium selenate activated Wnt/β-catenin signaling and repressed amyloid-β formation in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Exp Neurol, 2017, 297: 36-49.