蔣偉青，袁欣，劉晨，任瀟，王永剛

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）病理學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為腦內(nèi)淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1]。淀粉樣斑塊由β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積所形成，而Aβ由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)過蛋白水解作用而產(chǎn)生，APP代謝異常會導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生和清除失衡而導(dǎo)致Aβ過度沉積[2-3]。凋亡參與許多神經(jīng)退行性疾病如AD的神經(jīng)元死亡過程[4]。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的重要成員之一，在抑制凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂中起重要作用[4]。本研究探討survivin對APP代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 原代大鼠海馬神經(jīng)元、PC12細(xì)胞購自上海賽傲公司。survivin抗體、APP抗體及GAPDH內(nèi)參抗體購自英國Abcam公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光技術(shù)：細(xì)胞爬片用PBS浸洗后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗后，0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗后用山羊血清室溫封閉30 min，4 ℃孵育一抗過夜，PBST浸洗后，室溫避光孵育熒光二抗，PBST浸洗后，封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞接種到6孔板。次日，吸盡培養(yǎng)基，用Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次。對于每孔細(xì)胞，用200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋空載體1 μg、HA-APP質(zhì)粒1 μg、HAAPP質(zhì)粒和GFP-survivin質(zhì)粒[5]各1 μg，混勻放置10 min后將Lipofectamine 2000與質(zhì)粒混合，混勻后室溫放置25 min，加入到6孔板的細(xì)胞中推勻，將培養(yǎng)板放入37 ℃孵育，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行蛋白提取或凋亡染料染色。

1.2.3 Western blot：利用CockTail/RIPA（1∶100）裂解細(xì)胞提取總蛋白，測定蛋白濃度后定量加樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后用5% BSA于室溫慢搖封閉2 h，TBST洗滌后，4 ℃搖孵育一抗（5% BSA稀釋）過夜，TBST洗滌后，室溫慢搖孵育HRP二抗（5%BSA稀釋）2 h，TBST洗滌后進(jìn)行壓片顯影。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測：凋亡染色利用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，PI和Annexin V染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，利用CellQuest軟件對結(jié)果進(jìn)行分析、繪制散點(diǎn)圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色結(jié)果 通過免疫熒光染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)survivin與APP可以共存。這一結(jié)果提供了survivin在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)APP代謝的形態(tài)學(xué)證據(jù)（見圖1）。

圖1 大鼠海馬神經(jīng)元survivin與APP免疫熒光染色結(jié)果（×63）

2.2 Western blot檢測結(jié)果 將構(gòu)建好的HA-APP質(zhì)粒分別單轉(zhuǎn)染或者與GFP-survivin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染具有神經(jīng)元反應(yīng)性的PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞，通過Western blot檢測APP在PC12細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，APP和survivin共轉(zhuǎn)染組與APP單轉(zhuǎn)染組比，APP表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。這表明survivin可以抑制APP在PC12細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 將APP單轉(zhuǎn)染與APP和survivin共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞用凋亡染料PI和Annexin V染色后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，APP單轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡，APP和survivin共轉(zhuǎn)染后凋亡率明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。表明APP過量表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細(xì)胞凋亡。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)survivin與APP可以共存，survivin可以抑制APP在PC12細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，APP過量表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細(xì)胞凋亡。

凋亡是許多神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡過程的重要參與因素[4]。雖然一些臨床和亞臨床的研究已經(jīng)報(bào)道IAP的神經(jīng)保護(hù)作用，但是它們的臨床益處尚不清楚。Survivin在胚胎組織及有細(xì)胞增殖的組織均有表達(dá)[6-7]，且在炎癥組織[8]、創(chuàng)傷性腦損傷[9-10]和腫瘤組織[11-13]中有過表達(dá)。通過操縱survivin來抑制凋亡和調(diào)控有絲分裂從而達(dá)到神經(jīng)元的保護(hù)作用，因此可在神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)中得以利用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證明survivin基因（桿狀病毒IAP重復(fù)序列）突變體對分化后神經(jīng)細(xì)胞具有促進(jìn)分裂和增殖的作用[14]，另有動物研究報(bào)道，在腦損傷后，survivin參與調(diào)節(jié)成年小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞活性并抑制神經(jīng)元凋亡或程序性死亡[15]。另外，已有不同survivin突變體用于腫瘤治療的研究[16]，借鑒類似的方法，有助于開拓對神經(jīng)退行性

疾病治療的新思路。

圖2 Survivin抑制APP在PC12細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

圖3 Survivin抑制APP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

APP是APP家族蛋白成員之一，不同的酶促作用使其產(chǎn)生具有不同生理作用的衍生物。APP參與引起癡呆的最常見的退行性疾病，即AD的病理生理過程。另外，有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征的患者中APP表達(dá)升高。因此，研究參與調(diào)控APP代謝的機(jī)制對相關(guān)疾病的治療研究具有一定價(jià)值[17]。目前關(guān)于AD的病理生理解釋包括膽堿能假說、Aβ假說、tau蛋白假說和免疫假說[18]。其中主流的Aβ假說認(rèn)為，APP代謝異常會導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生和清除失衡而導(dǎo)致Aβ過度沉積[2-3]。目前臨床上對于AD的治療策略包括乙酰膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑[19]，對于AD治療策略的研究方向主要以Aβ和tau蛋白為靶點(diǎn)[18，20]。雖然目前尚未有利用survivin達(dá)到AD治療效果的報(bào)導(dǎo)，但是，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，予轉(zhuǎn)基因AD小鼠亞硒酸鈉飲食，可上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路并反式激活包括survivin在內(nèi)的基因表達(dá)，同時(shí)可減少APP磷酸化從而減少APP裂解和Aβ形成[21]，表明survivin在調(diào)節(jié)APP代謝中的潛在作用。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin可以抑制APP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)survivin可以抑制APP過表達(dá)所引起的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果對未來suivivin參與AD治療方面的研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

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