葉樂樂，張佳麗，陳文靜，沈賢，胡暢遠(yuǎn)，丁寧，薛向陽

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

UL138基因位于人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）ULb’區(qū)，與UL133、UL135及UL136等HCMV基因以多順反子形式轉(zhuǎn)錄，編碼的蛋白是一種多功能蛋白[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因是HCMV在人外周血單核細(xì)胞及CD34+髓系前體細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的建立與維持所必需的基因，其表達(dá)抑制單核細(xì)胞HCMV增殖，促進(jìn)病毒潛伏，UL138基因缺失將損害HCMV潛伏狀態(tài)的維持，為此，UL138被認(rèn)為是HCMV潛伏相關(guān)基因[2-3]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因的表達(dá)不影響正常胃黏膜細(xì)胞的基本生物學(xué)特征，但卻在胃癌細(xì)胞中扮演著抑癌基因的角色，通過封閉熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70），可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[4]，但UL138對腫瘤細(xì)胞免疫相關(guān)功能的影響尚不清楚。為此，本研究利用UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC-823，通過轉(zhuǎn)錄組差異基因分析結(jié)合免疫原性細(xì)胞死亡相關(guān)標(biāo)志檢測，分析UL138基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞免疫相關(guān)功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株：pcDNA3.1-flag/UL138重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并長期保存于-80 ℃冰箱。胃癌細(xì)胞BGC-823購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑、工具酶和抗體：脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Life Technology公司；FBS、1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自美國OMEGA公司；RealMaster Mix試劑盒、ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Toyobo公司；細(xì)胞因子定量PCR檢測試劑購自常州楚天生物科技有限公司；Flag抗體購自美國Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；HSP70抗體購自武漢Proteintech公司；ERp57抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞：將胃癌細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長至底面積的70%～80%時，將2 μg每孔的pcDNA3.1-flag/UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，操作按LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行，同時設(shè)空載質(zhì)粒pcDNA3.1作為陰性對照組。

1.2.2 Western blot法：收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，PBS洗滌2次，于冰上加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（PMSF∶RIPA 1∶100）裂解10 min，加入loading buffer后沸水煮沸10 min，于-80 ℃冰箱保存待用。樣品經(jīng)SDS-PAGE膠分離后并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，37 ℃下5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入一抗（兔抗GAPDH 1∶1000、兔抗Flag標(biāo)簽抗體1∶1000、兔抗HSP701∶5000、兔抗ERp571∶1000）4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次，5 min/次。于37 ℃加入二抗（羊抗兔1∶5000），搖床室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，5 min/次。PVDF膜加入ECL顯色液后于GelDoc2000儀器顯色并拍照。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞棄去原有培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌3次，5 min/次。加入4%多聚甲醛37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。再經(jīng)0.3% Triton X-100室溫下處理10 min，棄液并PBS洗滌3次，5 min/次。于37 ℃下5%山羊血清封閉1 h，兔抗Flag抗體（1∶800）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，5 min/次。FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體孵育1.5 h，加入1 μg/mL DAPI室溫下染色10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。加入抗熒光猝滅劑并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4UL138表達(dá)對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響：參照Trizol試劑使用說明書，提取UL138重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞總RNA，使用DNA去除試劑盒去除DNA污染并進(jìn)行基因芯片的分析。按照P＜0.05，F(xiàn)old change≥2確定差異表達(dá)基因。通過Metacore網(wǎng)站（https∶//portal.genego.com/），分別進(jìn)行Maps和Diseases分析，在各功能下載入UL138重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后2組間的差異基因，按需求進(jìn)行相應(yīng)選項(xiàng)分析。

1.2.5 候選差異表達(dá)基因驗(yàn)證：選擇部分差異表達(dá)的趨化因子及趨化因子受體進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。參照ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，產(chǎn)物于-20 ℃保存。RT-PCR條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，40 cycles。每個基因設(shè)立3個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，以Fold change分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及蛋白表達(dá)

2 結(jié)果

2.1UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及蛋白表達(dá)的驗(yàn)證 以本實(shí)驗(yàn)室保存的HCMV分離株為模板，含flag標(biāo)簽的UL138全長基因正向引物及反向引物擴(kuò)增UL138基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切載體pcDNA3.1后，將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒中，瓊脂糖凝膠電泳及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了含有UL138基因的重組質(zhì)粒（見圖1A）。將pcDNA3.1（+）-flag/UL138重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞24 h后，收集胃癌細(xì)胞的總蛋白，使用flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞能夠表達(dá)UL138蛋白，不含目的基因的對照質(zhì)粒未檢測到UL138蛋白表達(dá)（見圖1B）。此外，免疫熒光顯示UL138蛋白主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的胞漿中（見圖1C）。

2.2UL138基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

基因芯片差異基因分析顯示，UL138表達(dá)的胃癌細(xì)胞較對照組中存在576個基因差異表達(dá)（P＜0.05，F(xiàn)old change＞2），其中370個表達(dá)上調(diào)，206個表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析顯示UL138蛋白的表達(dá)參與細(xì)胞骨架重構(gòu)WNT途徑和細(xì)胞骨架重構(gòu)、免疫反應(yīng)IL-1信號通路、免疫反應(yīng)IL-8信號通路、細(xì)胞黏附纖維蛋白溶酶信號途徑、免疫反應(yīng)IL-5 JAK/STAT信號途徑、腫瘤組織因子表達(dá)靶位信號途徑、細(xì)胞黏附和趨化因子、免疫應(yīng)答的MIF介導(dǎo)的激素調(diào)控、關(guān)節(jié)炎中PDE4細(xì)胞趨化因子途徑、狼瘡性腎炎腎小管間質(zhì)損傷等通路（見圖2）。

2.3UL138基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞免疫相關(guān)分子的影

響 生物信息學(xué)分析顯示UL138蛋白的表達(dá)與消化系統(tǒng)疾病相關(guān)（見圖3）?；蛐酒治鲲@示，UL138表達(dá)上調(diào)免疫相關(guān)分子IL1A、IL6、IL11、IL8、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD274基因表達(dá)，下調(diào)CXCL10及IFNAR1基因表達(dá)。選擇與炎癥相關(guān)的部分基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，定量PCR結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果相符（見圖4）。

圖2 Maps分析UL138在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)參與的信號通路

圖3 Diseases分析與UL138表達(dá)相關(guān)的疾病

圖4 不同方法驗(yàn)證UL138表達(dá)對胃癌細(xì)胞免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響

2.4UL138基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞免疫原性死亡相關(guān)蛋白的影響 將pcDNA3.1-flag/UL138質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞18、24 h后，通過Western blot驗(yàn)證ERp57、HSP70蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，UL138在胃癌細(xì)胞中表達(dá)18、24 h后，ERp57蛋白表達(dá)量增加（P＜0.01），而HSP70蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 UL138表達(dá)對免疫原性死亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

UL138是HCMV基因組ULb’區(qū)中一個基因[5]，其編碼的蛋白是一種高爾基體定位的多功能蛋白[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因是一個新的病毒源性抑癌基因，具有抑制腫瘤生長并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用[6]。與癌旁正常胃黏膜組織比較，HCMV陽性的胃癌組織UL138表達(dá)水平明顯降低，尤其是在低分化胃癌組織。

已經(jīng)明確細(xì)胞死亡存在凋亡、壞死、自噬性細(xì)胞死亡、二次壞死、有絲分裂災(zāi)難等多種方式[7]。其中壞死、自噬性細(xì)胞死亡及部分的凋亡過程可改變細(xì)胞表面免疫分子表達(dá)并分泌炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8]。為分析UL138誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞過程免疫相關(guān)功能變化，本研究通過基因芯片分析UL138表達(dá)的胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UL138基因表達(dá)對IL1、IL8等免疫相關(guān)信號通路及細(xì)胞骨架重構(gòu)等通路產(chǎn)生影響，IL1A、IL6、IL8、IL11等促炎因子表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示，UL138誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞過程可促進(jìn)炎癥。既往的研究已經(jīng)明確，IL6及其他趨化因子的上調(diào)表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等惡性表型相關(guān)[9-12]，表明UL138表達(dá)明顯影響胃癌細(xì)胞免疫相關(guān)功能，但UL138對胃癌細(xì)胞的這些影響是否促進(jìn)惡性表型，有待于進(jìn)一步研究。

有研究提示，在某些誘導(dǎo)因素存在下，腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）的特征，能激發(fā)機(jī)體免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別與攻擊[13]。ICD的細(xì)胞表面高表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白、熱休克蛋白、高遷移率族遷徙族蛋白B1等特征性的蛋白分子[14-18]。為此，我們進(jìn)一步評價UL138表達(dá)對胃癌細(xì)胞ICD的影響，結(jié)果顯示，UL138表達(dá)盡管不改變HSP70表達(dá)，但刺激胃癌細(xì)胞在短時間內(nèi)表達(dá)與免疫原性死亡相關(guān)的蛋白（ERp57）。有研究表明，ERp57影響CRT從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜，敲除ERp57后，腫瘤細(xì)胞死亡過程中CRT不能向細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)移[13]，從而控制細(xì)胞的免疫原性。此外，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，UL138可明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞IL1A、IL6、IL11、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD274等免疫相關(guān)因子基因表達(dá)上調(diào)。提示，這些促炎細(xì)胞因子將提高樹突狀細(xì)胞對腫瘤抗原的識別和提呈的能力，促進(jìn)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞對腫瘤的攻擊，增強(qiáng)抗腫瘤的作用[7，19]。

綜上，UL138不但可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，還可通過改變腫瘤細(xì)胞免疫相關(guān)分子表達(dá)，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別與攻擊。

[1] PETRUCELLI A, UMASHANKAR M, ZAGALLO P, et al.Interactions between proteins encoded within the human cytomegalovirus UL133-UL138 locus[J]. J Virol, 2012, 86(16):8653-8662.

[2] GOODRUM F, REEVES M, SINCLAIR J, et al. Human cytomegalovirus sequences expressed in latently infected individuals promote a latent infection in vitro[J]. Blood, 2007,110(3): 937-945.

[3] UMASHANKAR M, PETRUCELLI A, CICCHINI L, et al.A novel human cytomegalovirus locus modulates cell typespecif i c outcomes of infection[J]. PLoS Pathog, 2011, 7(12):e1002444.

[4] CHEN W, LIN K, ZHANG L, et al. The cytomegalovirus protein UL138 induces apoptosis of gastric cancer cells by binding to heat shock protein 70[J]. Oncotarget, 2016, 7(5):5630-5645.

[5] LANDOLFO S, GARIGLIO M, GRIBAUDO G, et al. The human cytomegalovirus[J]. Pharmacol Ther, 2003, 98(3):269-297.

[6] CHEN W, LIN K, ZHANG L, et al. The cytomegalovirus protein UL138 induces apoptosis of gastric cancer cells by binding to heat shock protein 70[J]. Oncotarget, 2016, 7(5):5630-5645.

[7] GREEN D R, FERGUSON T, ZITVOGEL L, et al. Immunogenic and tolerogenic cell death[J]. Nat Rev Immunol,2009, 9(5): 353-363.

[8] GREEN D R. The end and after: how dying cells impact the living organism[J]. Immunity, 2011, 35(4): 441-444.

[9] EL-SERAG H B, RUDOLPH K L. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 132(7): 2557-2576.

[10] BOLLRATH J, PHESSE T J, VON B V A, et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis[J]. Cancer Cell, 2009, 15(2): 91-102.

[11] GRETEN F R, ECKMANN L, GRETEN T F, et al. IKKbeta links inf l ammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer[J]. Cell, 2004, 118(3): 285-296.

[12] THIEM S, PIERCE T P, PALMIERI M, et al. mTORC1 inhibition restricts inf l ammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2013, 123(2): 767-781.

[13] 王清, 王艷林. 腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡相關(guān)分子的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(1): 109-111.

[14] YANG Y, LI X J, CHEN Z, et al. Wogonin induced calreticulin/annexin A1 exposure dictates the immunogenicity of cancer cells in a PERK/AKT dependent manner[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e50811.

[15] KEPP O, TESNIERE A, SCHLEMMER F, et al. Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment[J]. Apoptosis, 2009, 14(4): 364-375.

[16] DE BRUYN M, WIERSMA V R, HELFRICH W, et al. The ever-expanding immunomodulatory role of calreticulin in cancer immunity[J]. Front Oncol, 2015, 5: 35.

[17] ARDELT P U, KNEITZ B, ADAM P, et al. Reactive antibodies against bacillus Calmette-Guerin heat-shock protein-65 potentially predict the outcome of immunotherapy for high-grade transitional cell carcinoma of the bladder[J].Cancer, 2010, 116(3): 600-609.

[18] 張峻嶺, 李衛(wèi)泊, 李冬斌, 等. 腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡中特征性表達(dá)抗原在抗瘤免疫應(yīng)答中的作用[J]. 免疫學(xué)雜志,2010, 26(8): 730-734.

[19] OBEID M, TESNIERE A, GHIRINGHELLI F, et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death[J]. Nat Med, 2007, 13(1): 54-61.