葉樂樂，張佳麗，陳文靜，沈賢，胡暢遠，丁寧，薛向陽

（1.溫州醫(yī)科大學 微生物學與免疫學教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學 仁濟學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州325015；4.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

UL138基因位于人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）ULb’區(qū)，與UL133、UL135及UL136等HCMV基因以多順反子形式轉錄，編碼的蛋白是一種多功能蛋白[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因是HCMV在人外周血單核細胞及CD34+髓系前體細胞內潛伏感染的建立與維持所必需的基因，其表達抑制單核細胞HCMV增殖，促進病毒潛伏，UL138基因缺失將損害HCMV潛伏狀態(tài)的維持，為此，UL138被認為是HCMV潛伏相關基因[2-3]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因的表達不影響正常胃黏膜細胞的基本生物學特征，但卻在胃癌細胞中扮演著抑癌基因的角色，通過封閉熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70），可顯著抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡[4]，但UL138對腫瘤細胞免疫相關功能的影響尚不清楚。為此，本研究利用UL138重組質粒轉染胃癌細胞BGC-823，通過轉錄組差異基因分析結合免疫原性細胞死亡相關標志檢測，分析UL138基因表達對胃癌細胞免疫相關功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和細胞株：pcDNA3.1-flag/UL138重組質粒由本實驗室構建并長期保存于-80 ℃冰箱。胃癌細胞BGC-823購自中國科學院細胞庫/干細胞庫。

1.1.2 主要試劑、工具酶和抗體：脂質體LipofectamineTM2000購自美國Life Technology公司；FBS、1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；質粒大量抽提試劑盒購自美國OMEGA公司；RealMaster Mix試劑盒、ReverTra Ace反轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司；細胞因子定量PCR檢測試劑購自常州楚天生物科技有限公司；Flag抗體購自美國Sigma公司；FITC標記的羊抗兔抗體購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；HSP70抗體購自武漢Proteintech公司；ERp57抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒轉染胃癌細胞：將胃癌細胞接種于六孔板，待細胞生長至底面積的70%～80%時，將2 μg每孔的pcDNA3.1-flag/UL138重組質粒轉染胃癌細胞，操作按LipofectamineTM2000產品說明書進行，同時設空載質粒pcDNA3.1作為陰性對照組。

1.2.2 Western blot法：收集轉染后的胃癌細胞，PBS洗滌2次，于冰上加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液（PMSF∶RIPA 1∶100）裂解10 min，加入loading buffer后沸水煮沸10 min，于-80 ℃冰箱保存待用。樣品經SDS-PAGE膠分離后并轉移至PVDF膜，37 ℃下5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入一抗（兔抗GAPDH 1∶1000、兔抗Flag標簽抗體1∶1000、兔抗HSP701∶5000、兔抗ERp571∶1000）4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次，5 min/次。于37 ℃加入二抗（羊抗兔1∶5000），搖床室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，5 min/次。PVDF膜加入ECL顯色液后于GelDoc2000儀器顯色并拍照。

1.2.3 細胞免疫熒光：將轉染后的胃癌細胞棄去原有培養(yǎng)液，預冷的PBS洗滌3次，5 min/次。加入4%多聚甲醛37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。再經0.3% Triton X-100室溫下處理10 min，棄液并PBS洗滌3次，5 min/次。于37 ℃下5%山羊血清封閉1 h，兔抗Flag抗體（1∶800）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，5 min/次。FITC標記的羊抗兔抗體孵育1.5 h，加入1 μg/mL DAPI室溫下染色10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。加入抗熒光猝滅劑并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4UL138表達對胃癌細胞轉錄組的影響：參照Trizol試劑使用說明書，提取UL138重組質粒及對照質粒轉染后的胃癌細胞總RNA，使用DNA去除試劑盒去除DNA污染并進行基因芯片的分析。按照P＜0.05，F(xiàn)old change≥2確定差異表達基因。通過Metacore網站（https∶//portal.genego.com/），分別進行Maps和Diseases分析，在各功能下載入UL138重組質粒及對照質粒轉染胃癌細胞后2組間的差異基因，按需求進行相應選項分析。

1.2.5 候選差異表達基因驗證：選擇部分差異表達的趨化因子及趨化因子受體進行RT-PCR驗證。參照ReverTra Ace反轉錄試劑盒說明書進行操作，產物于-20 ℃保存。RT-PCR條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，40 cycles。每個基因設立3個復孔，以GAPDH為內參，以Fold change分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 UL138重組質粒轉染胃癌細胞及蛋白表達

2 結果

2.1UL138重組質粒轉染胃癌細胞及蛋白表達的驗證 以本實驗室保存的HCMV分離株為模板，含flag標簽的UL138全長基因正向引物及反向引物擴增UL138基因，經限制性內切酶雙酶切載體pcDNA3.1后，將PCR產物克隆至pcDNA3.1質粒中，瓊脂糖凝膠電泳及測序結果表明成功構建了含有UL138基因的重組質粒（見圖1A）。將pcDNA3.1（+）-flag/UL138重組質粒轉染胃癌細胞24 h后，收集胃癌細胞的總蛋白，使用flag標簽抗體進行Western blot驗證，結果顯示，重組質粒轉染的胃癌細胞能夠表達UL138蛋白，不含目的基因的對照質粒未檢測到UL138蛋白表達（見圖1B）。此外，免疫熒光顯示UL138蛋白主要表達于胃癌細胞的胞漿中（見圖1C）。

2.2UL138基因表達對胃癌細胞基因表達譜的影響

基因芯片差異基因分析顯示，UL138表達的胃癌細胞較對照組中存在576個基因差異表達（P＜0.05，F(xiàn)old change＞2），其中370個表達上調，206個表達下調。生物信息學分析顯示UL138蛋白的表達參與細胞骨架重構WNT途徑和細胞骨架重構、免疫反應IL-1信號通路、免疫反應IL-8信號通路、細胞黏附纖維蛋白溶酶信號途徑、免疫反應IL-5 JAK/STAT信號途徑、腫瘤組織因子表達靶位信號途徑、細胞黏附和趨化因子、免疫應答的MIF介導的激素調控、關節(jié)炎中PDE4細胞趨化因子途徑、狼瘡性腎炎腎小管間質損傷等通路（見圖2）。

2.3UL138基因表達對胃癌細胞免疫相關分子的影

響 生物信息學分析顯示UL138蛋白的表達與消化系統(tǒng)疾病相關（見圖3）?；蛐酒治鲲@示，UL138表達上調免疫相關分子IL1A、IL6、IL11、IL8、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD274基因表達，下調CXCL10及IFNAR1基因表達。選擇與炎癥相關的部分基因進行驗證，結果顯示，定量PCR結果與基因芯片檢測結果相符（見圖4）。

圖2 Maps分析UL138在胃癌細胞中的表達參與的信號通路

圖3 Diseases分析與UL138表達相關的疾病

圖4 不同方法驗證UL138表達對胃癌細胞免疫相關分子表達的影響

2.4UL138基因表達對胃癌細胞免疫原性死亡相關蛋白的影響 將pcDNA3.1-flag/UL138質粒轉染胃癌細胞18、24 h后，通過Western blot驗證ERp57、HSP70蛋白表達，結果顯示，UL138在胃癌細胞中表達18、24 h后，ERp57蛋白表達量增加（P＜0.01），而HSP70蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 UL138表達對免疫原性死亡相關蛋白的影響

3 討論

UL138是HCMV基因組ULb’區(qū)中一個基因[5]，其編碼的蛋白是一種高爾基體定位的多功能蛋白[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，UL138基因是一個新的病毒源性抑癌基因，具有抑制腫瘤生長并促進胃癌細胞凋亡的作用[6]。與癌旁正常胃黏膜組織比較，HCMV陽性的胃癌組織UL138表達水平明顯降低，尤其是在低分化胃癌組織。

已經明確細胞死亡存在凋亡、壞死、自噬性細胞死亡、二次壞死、有絲分裂災難等多種方式[7]。其中壞死、自噬性細胞死亡及部分的凋亡過程可改變細胞表面免疫分子表達并分泌炎癥相關的細胞因子，促進炎癥反應[8]。為分析UL138誘導胃癌細胞過程免疫相關功能變化，本研究通過基因芯片分析UL138表達的胃癌細胞基因表達譜，結果發(fā)現(xiàn)，UL138基因表達對IL1、IL8等免疫相關信號通路及細胞骨架重構等通路產生影響，IL1A、IL6、IL8、IL11等促炎因子表達上調。這些結果提示，UL138誘導胃癌細胞過程可促進炎癥。既往的研究已經明確，IL6及其他趨化因子的上調表達，與腫瘤細胞轉移等惡性表型相關[9-12]，表明UL138表達明顯影響胃癌細胞免疫相關功能，但UL138對胃癌細胞的這些影響是否促進惡性表型，有待于進一步研究。

有研究提示，在某些誘導因素存在下，腫瘤細胞可出現(xiàn)免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）的特征，能激發(fā)機體免疫細胞對腫瘤細胞的識別與攻擊[13]。ICD的細胞表面高表達鈣網蛋白、熱休克蛋白、高遷移率族遷徙族蛋白B1等特征性的蛋白分子[14-18]。為此，我們進一步評價UL138表達對胃癌細胞ICD的影響，結果顯示，UL138表達盡管不改變HSP70表達，但刺激胃癌細胞在短時間內表達與免疫原性死亡相關的蛋白（ERp57）。有研究表明，ERp57影響CRT從內質網轉至細胞膜，敲除ERp57后，腫瘤細胞死亡過程中CRT不能向細胞膜表面轉移[13]，從而控制細胞的免疫原性。此外，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，UL138可明顯誘導胃癌細胞IL1A、IL6、IL11、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD274等免疫相關因子基因表達上調。提示，這些促炎細胞因子將提高樹突狀細胞對腫瘤抗原的識別和提呈的能力，促進腫瘤特異性細胞毒T細胞對腫瘤的攻擊，增強抗腫瘤的作用[7，19]。

綜上，UL138不但可誘導腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，還可通過改變腫瘤細胞免疫相關分子表達，進而激發(fā)機體免疫細胞對腫瘤細胞的識別與攻擊。

[1] PETRUCELLI A, UMASHANKAR M, ZAGALLO P, et al.Interactions between proteins encoded within the human cytomegalovirus UL133-UL138 locus[J]. J Virol, 2012, 86(16):8653-8662.

[2] GOODRUM F, REEVES M, SINCLAIR J, et al. Human cytomegalovirus sequences expressed in latently infected individuals promote a latent infection in vitro[J]. Blood, 2007,110(3): 937-945.

[3] UMASHANKAR M, PETRUCELLI A, CICCHINI L, et al.A novel human cytomegalovirus locus modulates cell typespecif i c outcomes of infection[J]. PLoS Pathog, 2011, 7(12):e1002444.

[4] CHEN W, LIN K, ZHANG L, et al. The cytomegalovirus protein UL138 induces apoptosis of gastric cancer cells by binding to heat shock protein 70[J]. Oncotarget, 2016, 7(5):5630-5645.

[5] LANDOLFO S, GARIGLIO M, GRIBAUDO G, et al. The human cytomegalovirus[J]. Pharmacol Ther, 2003, 98(3):269-297.

[6] CHEN W, LIN K, ZHANG L, et al. The cytomegalovirus protein UL138 induces apoptosis of gastric cancer cells by binding to heat shock protein 70[J]. Oncotarget, 2016, 7(5):5630-5645.

[7] GREEN D R, FERGUSON T, ZITVOGEL L, et al. Immunogenic and tolerogenic cell death[J]. Nat Rev Immunol,2009, 9(5): 353-363.

[8] GREEN D R. The end and after: how dying cells impact the living organism[J]. Immunity, 2011, 35(4): 441-444.

[9] EL-SERAG H B, RUDOLPH K L. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 132(7): 2557-2576.

[10] BOLLRATH J, PHESSE T J, VON B V A, et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis[J]. Cancer Cell, 2009, 15(2): 91-102.

[11] GRETEN F R, ECKMANN L, GRETEN T F, et al. IKKbeta links inf l ammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer[J]. Cell, 2004, 118(3): 285-296.

[12] THIEM S, PIERCE T P, PALMIERI M, et al. mTORC1 inhibition restricts inf l ammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2013, 123(2): 767-781.

[13] 王清, 王艷林. 腫瘤細胞免疫原性死亡相關分子的研究進展[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(1): 109-111.

[14] YANG Y, LI X J, CHEN Z, et al. Wogonin induced calreticulin/annexin A1 exposure dictates the immunogenicity of cancer cells in a PERK/AKT dependent manner[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e50811.

[15] KEPP O, TESNIERE A, SCHLEMMER F, et al. Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment[J]. Apoptosis, 2009, 14(4): 364-375.

[16] DE BRUYN M, WIERSMA V R, HELFRICH W, et al. The ever-expanding immunomodulatory role of calreticulin in cancer immunity[J]. Front Oncol, 2015, 5: 35.

[17] ARDELT P U, KNEITZ B, ADAM P, et al. Reactive antibodies against bacillus Calmette-Guerin heat-shock protein-65 potentially predict the outcome of immunotherapy for high-grade transitional cell carcinoma of the bladder[J].Cancer, 2010, 116(3): 600-609.

[18] 張峻嶺, 李衛(wèi)泊, 李冬斌, 等. 腫瘤細胞免疫原性死亡中特征性表達抗原在抗瘤免疫應答中的作用[J]. 免疫學雜志,2010, 26(8): 730-734.

[19] OBEID M, TESNIERE A, GHIRINGHELLI F, et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death[J]. Nat Med, 2007, 13(1): 54-61.