毛珊珊，王路得，周萌，呂開(kāi)績(jī)，朱進(jìn)順，Kamara Saidu，葉曉鮮，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所 病原生物與免疫學(xué)系，浙江 溫州 325035）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于人類(lèi)γ皰疹病毒科，廣泛存在于人群中，且主要以潛伏感染的形式存在。EBV感染與某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）、霍奇金病（Hodgkin’s lymphoma，HL）、鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）等[1]，且與某些自身免疫性疾病的發(fā)病也密切相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）[2]。EBV在潛伏感染的過(guò)程中表達(dá)3種潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A和LMP2B。其中，LMP1為66 kDa的跨膜蛋白，是由386個(gè)氨基酸組成的功能蛋白，在細(xì)胞膜上可形成多次跨膜，其N(xiāo)端的1～23和C端的187～386均游離于胞漿區(qū)，具有生物學(xué)意義[3]。EBV LMP1的N端在維持B細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)化及免疫調(diào)節(jié)上起作用，而胞

漿區(qū)的187～386段，即EBV LMP1 C端，是LMP1的功能區(qū)域，在EBV誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究選取了C端的200個(gè)氨基酸（187～386）作為研究對(duì)象，通過(guò)原核表達(dá)的方式制備了EBV LMP1 C端重組蛋白及其兔多克隆抗體，并檢驗(yàn)其生物學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1 材料E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；鼻咽癌細(xì)胞株C666-1、CNE-2Z、人黑色素瘤細(xì)胞株A375均由本實(shí)驗(yàn)室保存；1 kb DNA marker、DL2000 DNA marker、限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XhoI購(gòu)自美國(guó)NEB公司；鎳螯合親和層析膠（Ni-NTA Agarose）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）購(gòu)自上海杰瑞生物有限公司；His-tag單克隆鼠源抗體、HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）抗體、HRP Goat anti-Rabbit IgG（H+L）抗體、ECL化學(xué)發(fā)光液均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序分析：對(duì)LMP1 C端進(jìn)行密碼子優(yōu)化，送杭州擎科梓熙生物公司全基因合成，將公司合成的LMP1 C端基因構(gòu)建到pET21a（+）載體，并轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌中，挑取單個(gè)的菌落接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組蛋白表達(dá)、純化及鑒定：將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌中，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8；加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，250 r/min，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h；利用高速離心機(jī)收集菌液；PBS溶解后超聲裂解細(xì)菌，并12000 r/min離心10 min，收集上清；經(jīng)鎳螯合親和層析膠純化重組蛋白，收集得到LMP1 C端重組蛋白；經(jīng)SDS-PAGE分析；用His-Tag mAb為一抗，HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）為二抗，進(jìn)行Western blot分析和鑒定。

1.2.3 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體的制備：取4只白兔隨機(jī)分為2組，用于免疫EBV LMP1 C端蛋白和PBS；免疫蛋白前，對(duì)大耳白兔于耳緣靜脈采血，將樣品作為0周對(duì)照組；以500 μg/只的量于第1、第3、第5周依次進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射；初次免疫EBV LMP1 C端重組蛋白與完全弗氏佐劑以1∶1（V∶V）的比例混合乳化，第2、第3次免疫時(shí)換為不完全弗氏佐劑，并在第2、第4、第6周耳緣靜脈取血；第8周進(jìn)行心臟取血，37 ℃水浴1 h后于預(yù)冷的超速離心機(jī)中，4 ℃，4000 r/min離心20 min，收集上層血清，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體與重組蛋白結(jié)合的特異性檢測(cè)：LMP1 C端蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，用一抗稀釋液以1∶5000稀釋兔多克隆抗體，HRP標(biāo)

記的山羊抗兔二抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，ECL顯色。

1.2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體反應(yīng)及效價(jià)檢測(cè)：用包被緩沖液稀釋LMP1 C端蛋白，以終濃度10 μg/mL包被ELISA板，PBS免疫血清作為對(duì)照組；0.3 g/mL脫脂牛奶封閉；0、2、4、6、8周兔血清作為一抗；1∶10000稀釋的HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）為二抗；TMB顯色，H2SO4終止；酶標(biāo)儀讀

取450～630 nm處吸光值讀數(shù)。用ELISA方法檢測(cè)

免疫8周后血清抗體效價(jià)，將8周血清分別倍比稀為1∶40、1∶160、1∶640、1∶2560、1∶10240、1∶40960、1∶163840、1∶655360，所有血清標(biāo)本均重復(fù)3孔，讀取450～630 nm處吸光值讀數(shù)。

1.2.6 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性識(shí)別天然EBV LMP1蛋白：將C666-1、CNE-2Z、A375細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于細(xì)胞爬片上，置于4%多聚甲醛37 ℃固定10 min；0.3% triton x-10037 ℃孵育10 min；PBST洗3次，置于搖床上清洗，每次3 min；用5%山羊血清，置于37 ℃封閉90 min。取出6孔板，加入PBST，每孔2 mL，于搖床上清洗3 min；加入兔抗EBV C端蛋白多克隆抗體（1∶5000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；PBST洗3次；用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG（H+L）（1∶2000），避光37 ℃孵育1 h；PBST洗3次；避光加入RNA酶（1∶100）和PI（1∶1000）避光染色5 min；避光PBST洗3次；顯微鏡下觀(guān)察拍照。

2 結(jié)果

2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質(zhì)粒的鑒定

用NdeI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pET21a（+）/EBV LMP1 C端進(jìn)行酶切，得到一條約600 bp的條帶（見(jiàn)圖1）；選取陽(yáng)性菌株送公司測(cè)序分析，經(jīng)Blast比對(duì)，重組序列與目的片段完全一致。

2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質(zhì)粒的原核表達(dá)、純化及鑒定 培養(yǎng)含有pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質(zhì)粒的BL21（DE3）大腸桿菌，收集加入和未加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的樣品及純化后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在27 kDa處出現(xiàn)單一的蛋白條帶（見(jiàn)圖2A）。His-Tag mAb抗為一抗（1∶10000）進(jìn)行Western blot分析，在27 kDa處可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)條帶（見(jiàn)圖2B）。

1：1 kb DNA marker；2：pET21（+）；3：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I；4：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I+Xho I；5：DL 2000 DNA marker

圖2 EBV LMP1 C端蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳（A）和Western blot分析（B）

2.3 EBV LMP1 C端特異性兔多克隆抗體反應(yīng)及效價(jià) 采用ELISA方法對(duì)以重組蛋白LMP1 C端為抗原得到的兔血清抗體進(jìn)行檢測(cè)。重組蛋白包被酶標(biāo)板，0、2、4、6、8周兔多克隆抗體作為一抗，結(jié)果顯示，LMP1 C端重組蛋白免疫的白兔在第2周開(kāi)始產(chǎn)生特異性抗體，至第8周達(dá)到高峰（見(jiàn)圖3A）。取8周時(shí)血清做抗體稀釋滴度檢測(cè)，結(jié)果顯示，LMP1 C端兔多克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1∶40000（見(jiàn)圖3B）。

圖3 EBV LMP1 C端重組蛋白免疫兔血清抗體反應(yīng)（A）及效價(jià)分析（B）

2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性結(jié)合重組蛋白的檢測(cè) 利用Western blot方法對(duì)獲得的兔多克隆抗體與LMP1 C端蛋白結(jié)合和識(shí)別的特異性進(jìn)行檢測(cè)分析，以第8周兔多克隆抗體為一抗（1∶5000），在相對(duì)分子質(zhì)量27 kDa處可見(jiàn)特異性陽(yáng)性條帶（見(jiàn)圖4）。

圖4 兔血清EBV LMP1 C端Western blot分析

2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性識(shí)別天然EBV LMP1蛋白 選擇EBV LMP1表達(dá)陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞C666-1、CNE-2Z細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)選取LMP1表達(dá)陰性的人黑色素瘤細(xì)胞株A375作為對(duì)照組，用以檢測(cè)EBV LMP1 C端蛋白多克隆抗體與鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中天然表達(dá)的LMP1特異性識(shí)別和結(jié)合的能力。結(jié)果顯示，EBV LMP1 C端多克隆抗體能夠在C666-1和CNE-2Z的胞漿中，與LMP1特異性結(jié)合，表現(xiàn)為數(shù)個(gè)團(tuán)塊狀綠色熒光，而A375細(xì)胞中未見(jiàn)明顯的綠色熒光（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明，EBV LMP1 C端蛋白兔多克隆抗體能夠特異性識(shí)別細(xì)胞中天然表達(dá)的LMP1蛋白。

3 討論

圖5 LMP1 C端兔血清多克隆抗體特異性免疫熒光鑒定（×400）

EBV LMP1 C端是游離于胞漿區(qū)的200個(gè)氨基酸，含有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即C末端活化區(qū)域（C-termina1 activation region，CTAR）1、CTAR2和CTAR3，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域提供了信號(hào)分子對(duì)接蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，如TNFR相關(guān)因子（TNFR-associated factors，TRAFs）、TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TNFR-associated death domain，TRADD）、受體相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIP）和BS69等，通過(guò)NF-κB、p38-MAPK、PI3-K/Akt、ERKMAPK和JAK/STAT等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)[4-7]。從而產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞遷移等多種生物學(xué)作用[8-9]。如C端功能區(qū)的CTRA1和CTAR2可直接與TNFRs蛋白或TRADD結(jié)合，從而激活NF-κB的活性，促進(jìn)細(xì)胞增生[10-11]；CTAR3通過(guò)募集JAK3，進(jìn)而活化STAT3[12]。因此，EBV LMP1 C端的187～386氨基酸序列在EBV誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

通過(guò)原核表達(dá)制備靶蛋白，是研究靶蛋白生物學(xué)作用的重要途徑之一。目前研究表明，EBV LMP1可通過(guò)原核表達(dá)制備重組蛋白，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究，用于原核表達(dá)的載體主要包括pET32a載體和PGEM-T載體[13-15]，但這些載體表達(dá)的融合蛋白攜帶有載體本身蛋白，而載體蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的干擾作用。為此，本研究設(shè)計(jì)了起始密碼子后的第1個(gè)密碼子即為目的蛋白翻譯的起始密碼子，利用pET21a載體系統(tǒng)獲得的蛋白即為全長(zhǎng)目的蛋白，即LMP1 C端蛋白，從而避免了載體成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。經(jīng)過(guò)免疫日本大耳白兔制備的抗體具有效價(jià)高的特點(diǎn)，利用Western blot和免疫熒光分析，該蛋白可特異性識(shí)別EBV LMP1蛋白，表明本研究制備的EBV LMP1 C末端蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和抗原性。

目前，商業(yè)化的EBV LMP1單克隆抗體主要有下列幾種，即能識(shí)別位于LMP1 C端的多個(gè)抗原表位的單克隆抗體混合而成的抗體（CS1、CS2、CS3、CS4），可識(shí)別20種地理位置上不同的EBV分離株（CS 1～4）及可識(shí)別EBV LMP1 C末端Asp293-Asp312位點(diǎn)的單克隆抗體（D24-G）。但上述單克隆抗體仍然有一些問(wèn)題存在，如針對(duì)的抗原表位有限且成本昂貴。多克隆抗體則由于識(shí)別譜廣，制備簡(jiǎn)單方便，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，在免疫學(xué)檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)中具有較為廣泛的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)LMP1 C端蛋白制備的兔多克隆抗體，可特異性識(shí)別LMP1的C末端，且效價(jià)高，特異性強(qiáng)，可為EBV LMP1的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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