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        脾胃濕熱證大鼠模型血清蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)研究

        2018-07-03 12:02:12廖榮鑫劉小虹許仕杰
        新中醫(yī) 2018年7期
        關(guān)鍵詞:組學(xué)脾胃證候

        廖榮鑫,劉小虹,許仕杰

        1.廣東藥科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣東 廣州 510410;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006

        脾胃濕熱證是臨床常見的脾胃實證,中醫(yī)認(rèn)為其形成與氣候、飲食內(nèi)傷、疫氣以及體質(zhì)因素有關(guān)。由于脾胃濕熱證的特殊致病因素及其病理變化的特點,目前研究還處于籠統(tǒng)、多指標(biāo)、不確定狀態(tài),缺乏一個整體、統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn),有待進(jìn)一步多學(xué)科綜合研究。證候蛋白質(zhì)組學(xué)的提出,為整體研究證候?qū)嵸|(zhì)提供可能。血清中含有近萬種蛋白質(zhì),成分復(fù)雜,包括各種不同器官、組織和細(xì)胞分泌的多種蛋白質(zhì),機(jī)體每一時間段的病理生理改變均可在血清中反映出來[1]。因而從血清蛋白質(zhì)組學(xué)的角度,將蛋白質(zhì)組學(xué)和中醫(yī)證型研究結(jié)合起來,探討脾胃濕熱證在某一時期的相關(guān)蛋白質(zhì),對從整體水平研究、評價脾胃濕熱證的實質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。本研究從動物模型入手,對與脾胃濕熱證模型大鼠相關(guān)的血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行探討。

        1 材料和方法

        1.1 動物分組與模型制備 實驗用動物為6周齡SPF級SD雄性大鼠20只,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2003-0001,批次:20060241,于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng),體質(zhì)量(178.27±4.79)g。按照隨機(jī)數(shù)字表將實驗大鼠隨機(jī)分為模型組和正常對照組,每組10只。模型組大鼠于造模前禁食12 h,自由飲水,測定肛溫、體質(zhì)量、飲食量。造模時間共28天,采用肥甘飲食+造模箱+大腸桿菌造模法[2]。肥甘飲食(在普通飼料中混入12%豬油,8%蜂蜜)喂養(yǎng)10天,然后置于造模箱[溫度(33±2)℃,相對濕度85%~95%]8天,第19天開始灌胃,按10mL/kg給予大腸桿菌1次,24 h后再加強(qiáng)感染1次(1mL/200 g),移出置于實驗動物中心自然環(huán)境中,12 h后開始灌服蒸餾水,40mL/kg,每天2次,灌胃8天。正常對照組不予任何干預(yù)。

        1.2 標(biāo)本采集 第28天斷頭處死大鼠取全血,于4℃靜置30min后,以1 000 rpm的速度室溫離心5min,吸取上清液;置高速低溫離心機(jī),在4℃條件下,以10 000 rpm的速度離心8min,再吸取上清液,分裝置-80℃低溫冰箱保存。

        1.3 試劑和儀器 Sigma公司生產(chǎn)的3K18高速低溫離心機(jī);AmershamPharmacia公司生產(chǎn)的IPGphor及附件、GS-710光密度透射掃描儀;Bio-Rad公司生產(chǎn)的ProteanⅡ垂直電泳單元及附件、Mini-PROTEAN電泳單元及附件;HITACHI公司生產(chǎn)的U-2001紫外分光光度計;北京四環(huán)科學(xué)儀器制造廠生產(chǎn)的恒溫循環(huán)器HX-1055。實驗中所用試劑有:三羥基甲基氨基甲烷堿Tris、十二烷基硫酸鈉SDS、Bromopheolblue、Ultra urea、IPG buffer(pH 4~7)、固相pH梯度干膠條(IPG strip,13 cm,pH 3~ 10)(均購自 AmershamPharmacia 公司);AAm、Bis、Gly(購自 Bio-Rad 公司);PMSF(購自 Merck 公司);TEMED、Pharmalyte(pH 3~ 10)、CHAPS(購自 Sigma 公司);IAA、G250/R250(Fluka公司,批號:194863);LMWmarker(購自華美生物工程公司,批號:20061458);二硫蘇糖醇DTT(購自Promega公司),BSA(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所,批號:20061625)。

        1.4 二維凝膠電泳(2-DE) 分離和分析 考馬斯亮藍(lán)G250法[3]測定血清蛋白質(zhì)濃度,然后按等質(zhì)量分別混和模型組和正常對照組的血清樣本,以組間配對的方式同時進(jìn)行2-DE分離。采用18 cm長,pH值為4~7的固相pH梯度干膠條,上樣量為2.0 mg,以AmershamPharmacia Biotech公司IPGphor水平電泳儀進(jìn)行等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)。IEF過程中采用濾紙片作為“鹽橋”,設(shè)定250 V 30min,500 V 30min的低電壓除鹽過程,總電壓時間積約為50 000 Vh。平衡后的膠條置12.5%濃度的SDS凝膠作第二相分離。以考馬斯亮藍(lán)G250對凝膠做膠體考染,用GS710光密度透射掃描儀掃描凝膠并保存圖像。每組實驗重復(fù)3次,共獲得6張2-DE凝膠圖像。以Image Master 2DElite軟件進(jìn)行圖像分析,設(shè)定表達(dá)量提高2倍為差異表達(dá)范圍,獲取最終有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點信息。

        1.5 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢測 切取差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點,經(jīng)水洗、脫色處理后進(jìn)行膠內(nèi)酶切和萃取,獲得蛋白質(zhì)的肽混合樣品,再以美國ABI公司的Voyager DE STRMALDI-TOF質(zhì)譜儀對處理好的樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測,獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemass fingerprint,PMF)。以Mascot軟件搜索NCBInr和EMBL等數(shù)據(jù)庫,查詢PMF所對應(yīng)蛋白質(zhì)及相關(guān)信息。

        2 結(jié)果

        2.1 血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)蛋白分布圖 見圖1。在模型組大鼠和正常對照組大鼠血清中共找出12個表達(dá)量具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點。

        圖1 血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)蛋白分布圖位置(A為上調(diào)圖;B為下調(diào)圖)

        2.2 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)情況 見表1。按照在圖像中檢測到的序號來分,分別為點5、16、52、74、120、153、191、196、211、208、263、281。通過對PMF的數(shù)據(jù)庫檢索,12個血清差異蛋白質(zhì)中除3個血清差異蛋白質(zhì)未獲得滿意的PMF圖譜,故無法檢出其具體物質(zhì),其余9個可獲得數(shù)據(jù)庫的匹配信息,分別為備解素B因子、凝血因子Ⅱ、C-反應(yīng)蛋白、alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、載脂蛋白AI、重組人載脂蛋白AI、血小板凝血酶敏感蛋白、α-巨球蛋白、補(bǔ)體3。

        3 討論

        近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時代的標(biāo)志,目前已運(yùn)用到包括疾病標(biāo)志物研究、作用機(jī)制研究、藥物作用靶點研究、個性化醫(yī)療等多個領(lǐng)域中[4]。將蛋白質(zhì)組學(xué)引入到中醫(yī)證候的研究,主要通過對同一疾病不同證候和同一證候不同疾病的組織或細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)證候間的相同及差異之處,進(jìn)而揭示中醫(yī)證候的本質(zhì),蛋白質(zhì)組學(xué)的整體性、復(fù)雜性、動態(tài)性、信息化的特點和中醫(yī)學(xué)的理念不謀而合[5]。袁宏偉等[6]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冠心病心腎陰虛證的內(nèi)在基礎(chǔ),并找出了證型間的差異表達(dá)蛋白。孟慶宏等[7]分別從中醫(yī)證和蛋白質(zhì)組的概念、內(nèi)涵、特點、共性等幾個方面對將蛋白質(zhì)組學(xué)引入中醫(yī)證候的研究進(jìn)行了探討,認(rèn)為將蛋白質(zhì)組學(xué)引入到中醫(yī)證候?qū)W研究,為中醫(yī)證候物質(zhì)和功能基礎(chǔ)研究提供了新思路,對揭示中醫(yī)證的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。

        表1 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)情況

        從本研究篩選出的9個差異蛋白質(zhì)可以看出,脾胃濕熱證模型大鼠差異表達(dá)的蛋白主要涉及機(jī)體免疫、物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及血液流變學(xué)等方面。與脾胃濕熱證免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白有補(bǔ)體3、α-巨球蛋白、備解酶B因子。補(bǔ)體3、α-巨球蛋白表達(dá)均下降,備解素B因子表達(dá)上調(diào),三者共同作用分別從激素調(diào)節(jié)、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和受體分解等方面共同發(fā)揮作用,引起機(jī)體免疫力下降,和已有關(guān)于脾胃濕熱證免疫力下降的諸多研究結(jié)果[8~10]是一致的。《素問》認(rèn)為:“脾胃為水谷之?!?、“脾胃為后天之本”,脾胃功能衰弱,脾胃運(yùn)化水谷精微功能失調(diào),則正氣受損,是易于感受外邪而發(fā)病的基礎(chǔ)。因此,研究提示的免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)下降,引起機(jī)體免疫功能減低,可能是脾胃濕熱證正氣不足,易受邪而發(fā)病的實質(zhì)所在。

        與機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)有alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和C-反應(yīng)蛋白。C-反應(yīng)蛋白是反映炎癥反應(yīng)的指標(biāo)[11],alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4是感染、炎癥、創(chuàng)傷時常發(fā)生急性期反應(yīng)蛋白[12]。在脾胃濕熱證大鼠血清中,C-反應(yīng)蛋白表達(dá)下調(diào),alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達(dá)上調(diào)。C-反應(yīng)蛋白表達(dá)下降及alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4表達(dá)上調(diào),這一結(jié)果與楊春波等[8]發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證涉及的病種中,以炎癥性疾病占大多數(shù),尤其與以循環(huán)系統(tǒng)障礙、滲出為主的急性期炎癥和亞急性期炎癥更為密切,說明脾胃濕熱證炎癥的存在并不易愈合。

        與機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)有重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI,二者在調(diào)節(jié)脾胃濕熱證機(jī)體的脂肪代謝以及胰島素的釋放等方面發(fā)揮著重要的作用。重組人載脂蛋白AI及載脂蛋白AI表達(dá)均增強(qiáng),提示機(jī)體脂肪蓄積太多,載脂蛋白表達(dá)增強(qiáng),代償性加快脂類在機(jī)體內(nèi)的代謝,和模型動物使用高糖高脂飼料后表現(xiàn)為飲食減少、體質(zhì)量增加有關(guān);與中醫(yī)理論的脾主運(yùn)化功能失常引起脾胃運(yùn)化水谷功能下降,水濕內(nèi)停的理論一致。

        與血液流變學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)有凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白,二者表達(dá)均增強(qiáng)。凝血因子Ⅱ是凝血酶原被激活形成凝血酶過程中釋放的產(chǎn)物,若增高提示體內(nèi)有凝血酶形成。脾胃濕熱患者存在著凝血方面的異常。研究表明慢性胃病不同證型都存在血流變的異常,脾胃濕熱證最突出,曹代娣[13]研究表明,血液流變異常程度為脾胃濕熱型>肝郁氣滯型>脾胃虛弱型。鄭家鏗等[14]研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證存在著高血黏、高血凝、高血細(xì)胞壓積等特點。凝血因子Ⅱ、血小板凝血酶敏感蛋白在脾胃濕熱證的表達(dá)均增強(qiáng),說明脾胃濕熱證在血液流變學(xué)上具有高凝、高黏的特點,與先前學(xué)者的相關(guān)研究報道[15]相一致。

        本研究從動物模型出發(fā),初步探討了和脾胃濕熱證相關(guān)的血清特異表達(dá)蛋白質(zhì),這些蛋白主要涉及機(jī)體免疫、物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及血液流變學(xué)等方面,和現(xiàn)有的脾胃濕熱證的相關(guān)研究結(jié)果是一致的,證實了從蛋白質(zhì)組的角度來研究脾胃濕熱證實質(zhì)是可行的。中醫(yī)證型的形成和發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果,今后還需要進(jìn)一步將脾胃濕熱證相關(guān)的動物模型、臨床病例的血清或者組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)合起來比較分析,對不同的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和功能驗證,更深入地探討脾胃濕熱證的相關(guān)蛋白質(zhì),以闡釋脾胃濕熱證的實質(zhì)。

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