成麗嵐，黃金華，馬愛(ài)江，齊 杉，鄭少雄

(1. 河北省直屬機(jī)關(guān)第二門診部,河北 石家莊 050051；2. 北京市中關(guān)村醫(yī)院，北京 100080；3. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211)

隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率迅猛增長(zhǎng)，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，目前對(duì)糖尿病引起的終末期腎病尚無(wú)特效治療方法。普羅布考是一種調(diào)脂及抗氧化應(yīng)激的藥物，對(duì)糖尿病腎病有一定治療作用，但機(jī)制不明確。本研究觀察了普羅布考對(duì)糖尿病腎病大鼠血脂、氧化應(yīng)激指標(biāo)及足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、podocin、CD2AP表達(dá)的影響，旨在探討普羅布考對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠36只，平均體質(zhì)量220 g，購(gòu)于北大醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK(京)2007-0001。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)、普羅布考(齊魯制藥)、生化指標(biāo)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)、糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)定試劑盒及氧化還原指標(biāo)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)、目的及內(nèi)參基因引物DNA(大連寶生物工程有限公司合成)及Nephrin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3分組及模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)所選動(dòng)物3 d后，按照體質(zhì)量分層隨機(jī)原則分為正常組10只、模型組13只和普羅布考組13只，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和普羅布考組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，模型組和普羅布考組以小劑量STZ(15～25 mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功)。結(jié)果模型組造模成功12只，普羅布考組造模成功11只。之后普羅布考組給予普羅布考500 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃，均1次/d，連續(xù)8周，期間模型組和普羅布考組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，正常組普通飼料喂養(yǎng)。從造模成功到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常組存活9只大鼠，模型組和普羅布考組各存活8只大鼠。

1.4動(dòng)物取材及指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,剪尾取血，用美國(guó)強(qiáng)生血糖儀測(cè)空腹血糖(FPG)水平；股動(dòng)脈放血，用荷蘭MERCK公司半自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、胰島素水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)]水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×INS/22.5。然后脫頸致死取出雙腎,取一部分腎皮質(zhì)組織放于甲醛固定液中保存，免疫組化法檢測(cè)Nephrin蛋白表達(dá)情況；剩余腎皮質(zhì)組織置于液氮中保存，備做RT-PCR檢測(cè)。

1.5Nephrin、podocin和CD2AP mRNA檢測(cè)方法采用經(jīng)典Trizol法提取腎皮質(zhì)組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Nephrin、podocin、CD2AP和β-actin的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為171,253,454和199 bp。經(jīng)檢索基因文庫(kù)確認(rèn)引物基因。引物序列：Nephrin上游為5’-GGGGACCCCTCTATGATGAA-3’,下游為5’-GTGAAGCGTCTCACACCAGA-3’;podocin上游為5’-GCAGCCACGGTAGTGAATGT-3’,下游為5’-CAGGAAGCAGATGTCCCAGT-3’;CD2AP上游為5’-TGCTCCTCAAGTCCCACC-3’,下游為5’-CTCCGACGGCTTTATGTT-3’;β-actin上游為5’-TAAAGGGCATCCTGGGCTACAATG-3’,下游為5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3’。反應(yīng)結(jié)束后，取上述PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性條帶吸光度積分掃描，以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.13組血脂指標(biāo)比較 模型組和普羅布考組血清TG、TC、LDL-C水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，HDL-C水平與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；普羅布考組血清TC、LDL-C水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，TG和HDL-C水平均有高于模型組的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.23組血糖、胰島素和HOMA-IR比較 模型組和普羅布考組FPG、HbA1c、HOMA-IR均明顯高于正常組(P均<0.05)，但模型組和普羅布考組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；3組胰島素水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 3組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2 3組大鼠血糖及胰島素比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.33組血清SOD、GSH-Px及MDA含量比較模型組血清SOD、GSH-Px含量均明顯低于正常組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于正常組(P<0.05)；普羅布考組血清SOD、GSH-Px含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA含量明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠血清SOD、GSH-Px及MDA含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.43組腎組織中Nephrin蛋白表達(dá)情況 正常組Nephrin蛋白只在腎小球表達(dá)，圍繞腎小球毛細(xì)血管襻線狀排列，見(jiàn)圖1；其光密度值0.232±0.018。模型組Nephrin蛋白在腎小球表達(dá)紊亂，部分呈顆粒狀分布，見(jiàn)圖2；其光密度值 0.179±0.011，明顯低于正常組(P<0.05)。普羅布考組Nephrin蛋白表達(dá)介于正常組和模型組，見(jiàn)圖3；其光密度值0.207±0.112，明顯低于模型組(P<0.05)。

圖1 正常組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達(dá)情況(×400)

圖2 模型組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達(dá)情況(×400)

圖3 普羅布考組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達(dá)情況(×400)

2.53組腎皮質(zhì)中Nephrin、podocin、CD2AP mRNA表達(dá)情況 模型組Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05)，普羅布考組Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表4及圖4～6。

表4 3組大鼠腎皮質(zhì)中Nephrin、podocin、CD2AP mRNA表達(dá)情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為Nephrin

圖4 3組大鼠腎皮質(zhì)中Nephrin mRNA表達(dá)情況

3 討 論

糖尿病腎病早期臨床表現(xiàn)為蛋白尿，蛋白尿的形成與濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)受損有關(guān)[1]。腎小球?yàn)V過(guò)屏障的臟層上皮細(xì)胞因其胞體伸出許多偽足，故又稱足細(xì)胞。而足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能的主要細(xì)胞之一[2]。因?yàn)樽慵?xì)胞相互交叉形成濾過(guò)裂孔，裂孔由極薄的裂隙膜相連，裂隙膜表面的分子受損，且足細(xì)胞的增殖能力弱，不能有效阻擋蛋白等大分子物質(zhì)的濾過(guò)，導(dǎo)致蛋白尿，進(jìn)而引起并加重腎臟損傷。黃勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤霉素腎病大鼠蛋白尿的出現(xiàn)與足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷密切相關(guān)。

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為podocin

圖5 3組大鼠腎皮質(zhì)中podocin mRNA表達(dá)情況

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為CD2AP

圖6 3組大鼠腎皮質(zhì)中CD2AP mRNA表達(dá)情況

Nephrin是一種跨膜蛋白，是細(xì)胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族成員[4]；Nephrin分子在裂隙膜區(qū)鄰近的足突之間彼此相互延伸，形成似拉鏈樣多隙濾過(guò)結(jié)構(gòu)，這對(duì)于維持腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性起關(guān)鍵作用，故有研究提出Nephrin可作為預(yù)測(cè)腎小球疾病發(fā)展的檢測(cè)指標(biāo)[5]。CD2AP屬于免疫球蛋白家族中的跨膜蛋白，可與相關(guān)細(xì)胞上的CD2受體結(jié)合，對(duì)維持腎小球?yàn)V過(guò)膜的超微結(jié)構(gòu)及功能起到了重要作用。CD2AP在腎臟中主要表達(dá)于足突細(xì)胞[6]。Lv等[7]報(bào)道CD2APmRNA表達(dá)與24 h尿蛋白定量、腎小球硬化程度呈負(fù)相關(guān)，可作為評(píng)估腎小球病變程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。podocin為Stomatin蛋白家族新成員之一，Schwarz等[8]和Lehtonen等[9]的研究均發(fā)現(xiàn)CD2AP、Nephrin和podocin三者緊密聯(lián)系共同嵌于腎小球裂隙膜中，而裂隙膜的完整性是腎小球?yàn)V過(guò)機(jī)械屏障的關(guān)鍵。王詠梅等[10]發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠腎組織中Nephrin mRNA表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組。李秋月等[11]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中Nephrin、podocin和CD2AP表達(dá)下調(diào)。鄧順友等[12]發(fā)現(xiàn)糖尿病長(zhǎng)期高糖環(huán)境下糖基化終末產(chǎn)物及氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用導(dǎo)致糖尿病大鼠足細(xì)胞相關(guān)分子 Nephrin、podocin和 CD2AP蛋白表達(dá)均下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中Nephrin蛋白和Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常大鼠，與上述研究結(jié)果一致；且糖尿病大鼠血脂水平高于正常大鼠，抗氧化應(yīng)激能力明顯低于正常大鼠。推測(cè)糖尿病大鼠抗氧化能力減弱，糖脂代謝紊亂，損害了裂隙膜的完整性，使關(guān)鍵分子Nephrin、podocin和CD2AP基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損，這可能是糖尿病腎臟損傷、蛋白尿出現(xiàn)的機(jī)制。

普羅布考降脂作用明確，其可以降低HDL-C和糖尿病腎病患者的蛋白尿，保護(hù)腎功能[13]。本研究結(jié)果顯示，普羅布考組血清TC、LDL-C水平和MDA含量均明顯低于模型組，血清SOD、GSH-Px含量及腎組織中Nephrin蛋白和Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組。推測(cè)普羅布考可能通過(guò)降低血脂水平和提高抗氧化能力，上調(diào)足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、podocin、CD2AP的表達(dá)水平改善腎臟超微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。但是普羅布考干預(yù)后TG水平升高原因尚不清楚，有待研究。

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