涂豐霞 張惠梅 謝慶鳳 龐瓊怡 陳翔

腦卒中患者常遺留認知功能障礙，主要表現(xiàn)為學習記憶功能缺損。在谷氨酸受體中，N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate acid,NMDA）受體與學習記憶的關系最為密切。N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞單位2B（N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NR2B）是 NMDA受體中主要的功能亞單位，在學習和記憶的調(diào)控中起重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)小凹蛋白1（Caveolin-1）能影響谷氨酸受體通道從而增強突觸的傳遞效率，并改善樹突棘的形態(tài)結構和促進新棘的形成，進而促進長時程增強，起到改善認知及學習記憶能力的作用[2-3]。芹菜素屬于黃酮類化合物，研究表明其具有改善認知和記憶功能的作用[4-5]，但其具體機制仍有待進一步探明。本研究觀察芹菜素對腦缺血后大鼠認知功能的改善作用及對Caveolin-1及NR2B表達的影響，探討其改善腦缺血大鼠認知功能的相關機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠32只，3～4月齡，體重（250±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，飼養(yǎng)于濕度 60%、室溫（25±1）℃的環(huán)境下，大鼠自由飲食及活動。

1.1.2 主要試劑 芹菜素（≥99%純度）購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司。先用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）配成母液待用，使用時用0.9%氯化鈉溶液配成濃度 11.6×10-3mol/L 溶液。Caveolin-1（ab2910）、NR2B（ab65783）抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及分組 參照Belayev等[6]報道的線栓法加以改良后建立大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）再灌注模型。大鼠以左側為栓塞側，用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部剃毛，常規(guī)消毒后，切開正中皮膚及淺筋膜，分離出左側頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及其分支，結扎頸外動脈及其分支，用血管剪在頸外動脈近分叉處剪一細小切口，小心插入栓線，把已結扎的頸外動脈及其分支剪斷，輕輕牽拉頸外動脈，使其與頸內(nèi)動脈成一直線，栓線繞過頸總動脈分叉，進入頸內(nèi)動脈往顱內(nèi)方向推進，微遇阻力后停止，插入深度約18～22mm，表明此時大腦中動脈血流已被阻斷。大鼠腦缺血1.5h時，在麻醉狀態(tài)下拔除栓線，即可實現(xiàn)大腦中動脈再灌注。造模后將大鼠置于清潔的鼠籠內(nèi)，自由飲食、飲水及活動。假手術組操作步驟同上，剝離頸動脈后隨即縫合創(chuàng)口。大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：假手術組、模型組、低劑量芹菜素干預組（低芹菜素組）及高劑量芹菜素干預組（高芹菜素組），每組8只。低、高芹菜素組于造模同時分別腹腔注射芹菜素溶液20mg/kg或40mg/kg，之后1次/d，連續(xù)28d。假手術組和模型組于相同時間腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。4組大鼠均在造模后前3d腹腔注射8 000U慶大霉素預防感染。造模后第28天處死大鼠，留取缺血側海馬組織，進行相關指標檢測。

1.2.2 行為學評估 （1）神經(jīng)行為學評分：造模后1d進行。按照Zea Longa[7]5分制評分標準，0分：沒有神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸展對側前肢；2分：行走時向偏癱側轉圈；3分：行走時向偏癱側傾倒；4分：意識障礙，不能自發(fā)行走；5分：死亡。術后評分1至3分即為造模成功，進行后續(xù)實驗。（2）水迷宮測試：①定位航行實驗：給藥第23～27天，每天上午將4組大鼠從某一特定象限面向池壁入水，記錄90s內(nèi)大鼠尋找并爬上平臺的時長（逃避潛伏期），以此作為學習記憶能力的指標。若實驗動物90s內(nèi)未找到平臺，則引導其站上平臺并停留10s，并將其逃避潛伏期計為90s。②空間探索實驗：第27天下午，將平臺撤除，將動物由位于原先平臺象限的對側邊放入水中。記錄動物在目標象限（原先放置平臺的象限）所花的時間（空間探索時間）以此反映大鼠對平臺所在位置的記憶能力。

1.2.3 腦組織病理改變 腦組織石蠟切片脫蠟至水，HE染色，觀察腦組織病理改變。

1.2.4 檢測Caveolin-1和NR2B mRNA表達水平 （1）采用RT-qPCR法檢測Caveolin-1和NR2B mRNA表達：Trizol試劑盒提取總RNA。反轉錄反應體系的配置：2×RT buffer（10μl），6N 隨機引物（1μl）、RT-mix（1μl）、模板 RNA（5μl）、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水（3μl）；反轉錄條件設置：25℃10min，42℃50min，85℃ 5min。定量PCR反應體系的配置：2×PCR buffer（25μl）、Primers（1μl×2）、Sybr green I（0.5μl）、模板 cDNA（2μl）、DEPC 水（20.5μl）；擴增條件的設置：94℃ 4min，94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán) 35 次，72℃檢測信號。（2）采用Western blot法檢測Caveolin-1蛋白表達：常規(guī)蛋白提取、電泳、轉膜、封閉，一抗為1∶500稀釋兔抗鼠單克隆抗體，1∶1 000用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記，顯色、顯影、定影、攝像。Bandscan軟件條帶分析，計算灰度值。以內(nèi)參條帶甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh）和目的條帶的積分光密度值之比作為反映目的蛋白的表達水平。（3）采用免疫組化法檢測NR2B表達部位及蛋白表達量：腦組織石蠟切片脫蠟至水，抗體修復，封閉，一抗（1∶100）4℃孵育過夜，生物素標記羊抗鼠IgG孵育，37℃恒溫60min，加顯色劑 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate,DAB）顯示。蘇木素復染核1min，脫水，透明，封片?？瞻讓φ掌豢褂?.01mol代替。每只大鼠任取1張免疫組化切片，在統(tǒng)一放大倍數(shù)（×400）下，于腦缺血側海馬區(qū)隨機選取5個視野攝片后，用美國IPP 6.0分析軟件進行圖像分析，測定陽性細胞吸光度值（OD）值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以±s表示。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD-t檢驗，方差不齊者用Dunnett′T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠逃避潛伏期及空間探索時間比較見表1。

表1 4組大鼠逃避潛伏期及空間探索時間比較（s）

由表1可見，模型組大鼠第26天、第27天逃避潛伏期均大于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.138、3.001，均P＜0.05）。高芹菜素組大鼠第26天逃避潛伏期小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.521，P＜0.05）。高、低芹菜素組大鼠第27天逃避潛伏期均小于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.193、2.283，均P＜0.05）。模型組大鼠空間探索時間小于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.789，P＜0.01）；高、低芹菜素組大鼠空間探索時間均大于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.368、2.060，均 P＜0.05）。

2.2 4組大鼠腦缺血側海馬組織病理改變見圖1。

圖1 4組大鼠腦缺血側海馬組織病理改變（a：假手術組；b：模型組；c：低芹菜素組；d：高芹菜素組；HE染色，×400）

由圖1可見，假手術組海馬神經(jīng)元排列整齊，細胞形態(tài)學和大小正常。模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列松散，細胞體固縮，部分核固縮、核斷裂、核溶解甚至消失。芹菜素干預組大鼠海馬神經(jīng)元損傷較模型組輕。

2.3 4組大鼠腦缺血側海馬組織Caveolin-1和NR2B表達水平比較見表2。

由表2可見，高、低芹菜素組Caveolin-1 mRNA表達均高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.724、2.371，均P＜0.05）。高芹菜素組Caveolin-1 mRNA表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.321，P＜0.05）。模型組、高、低芹菜素組Caveolin-1蛋白表達均高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.582、5.135、2.697，均 P＜0.05）。高芹菜素組Caveolin-1蛋白表達高于模型組與低芹菜素組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.553、2.438，均P＜0.05）。高、低芹菜素組NR2B mRNA表達高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.785、2.572，均 P＜0.05）。模型組NR2B蛋白表達低于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.182，P＜0.05）。高、低芹菜素組NR2B蛋白表達均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.016、2.870，均P＜0.05）。Caveolin-1蛋白表達的Western blot條帶見圖2。免疫組化結果顯示NR2B蛋白主要在胞質(zhì)胞膜表達見圖3。

表2 4組大鼠腦缺血側海馬組織Caveolin-1和NR2B表達水平比較

圖2 4組大鼠腦缺血側海馬組織Caveolin-1蛋白表達電泳圖

圖3 4組大鼠腦缺血側海馬組織NR2B蛋白表達（a：假手術組；b：模型組；c：低芹菜素組；d：高芹菜素組，均為免疫組化，×400，箭頭所示為NR2B染色陽性顆粒，主要在胞質(zhì)胞膜表達）

3 討論

認知功能是人腦的一個重要功能，超過75%的腦卒中患者可能遺留認知功能障礙，包括記憶力、定向力、注意力等的缺陷，嚴重影響他們的生活質(zhì)量。芹菜素是一種天然植物，具有神經(jīng)保護作用。有報道芹菜素可以降低Aβ含量，緩解阿爾茨海默病的認知和記憶損害[4]。我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過抑制組蛋白去乙?；富钚?，調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化，誘導腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）和突觸蛋白 I（synapsin I，Syn-I）表達，起到改善腦卒中后認知功能障礙的作用[5]。本研究結果顯示，芹菜素改善腦卒中后認知功能障礙可能與調(diào)控Caveolin-1、NR2B表達有關。

腦缺血再灌注損傷后會產(chǎn)生明顯的認知和記憶障礙。我們實驗結果顯示，模型組大鼠尋找隱蔽平臺的時間較假手術組延長，說明造模后大鼠的空間記憶能力下降。芹菜素組比模型組的空間定位和記憶功能均明顯有改善。為了評估最小的有效芹菜素劑量，我們用了兩個不同劑量的芹菜素來干預?？臻g探索實驗證明，不同劑量芹菜素組的空間探索時間較模型組明顯增加，且兩劑量組間差異無統(tǒng)計學意義。低芹菜素組在第26天時尋找隱蔽平臺時間與模型組比較無明顯差異，高芹菜素組在第26天即出現(xiàn)尋找隱蔽平臺時間較模型組縮短，提示高劑量芹菜素改善腦缺血大鼠認知記憶作用可能優(yōu)于低劑量芹菜素，可加大樣本量做進一步的研究。

Caveolin-1是一種轉膜清道夫蛋白，被發(fā)現(xiàn)存在于膜脂質(zhì)筏，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi)表達豐富。有實驗表明，Y-迷宮學習訓練后大鼠皮層內(nèi)Caveolin-1表達升高，提示Caveolin-1在分辨學習記憶過程中起作用[8]。Caveolin-1與腦功能的生理和病理變化有關，它影響神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性等過程[9]。神經(jīng)元過表達Caveolin-1增加神經(jīng)膜/脂質(zhì)筏功能，Caveolin-1定位在海馬神經(jīng)元的生長錐體和樹突，促進神經(jīng)元的分化和成熟[10]，促進海馬依賴的學習和記憶功能的改善[11-12]。另外，Caveolin-1表達增加，促進突觸前蛋白和突觸后蛋白表達增加，在突觸可塑性中起重要的作用。我們的結果顯示腦缺血后Caveolin-1表達升高，與以往的報道一致[13-14]。但是本研究結果與Shen等[15]研究結果不一致，他們的研究顯示在腦缺血再灌注早期隨著一氧化氮產(chǎn)生的增多會抑制Caveolin-1表達，考慮可能與模型缺血再灌注時間差異及實驗方案的不同等有關。芹菜素干預能促進Caveolin-1表達，同時大鼠記憶認知功能明顯有改善，主要是高劑量芹菜素起作用，而低劑量芹菜素作用不明顯。

NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的興奮性氨基酸受體，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、樹突和軸突的結構發(fā)育、突觸的可塑性及突觸重排等，對神經(jīng)回路的形成及學習記憶過程起促進作用。NR2B是NMDA受體的主要調(diào)節(jié)亞單位，在腦缺血的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮很重要的作用。急性腦缺血時NR2B亞基表達增加或功能增強會加重缺血性腦損傷的興奮毒性損害，而慢性腦缺血后期其表達下調(diào)可能與血管性癡呆患者的認知功能障礙有關。NR2B不僅參與學習、記憶、介導缺血性腦損傷，而且是突觸可塑性、皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元長時程增強效應的主要調(diào)控者[16-17]。Nakamori等[18]發(fā)現(xiàn)，在大鼠學習記憶訓練后，學習記憶主要區(qū)域NR2B蛋白表達升高。本研究結果顯示腦缺血后期缺血側海馬腦組織NR2B表達下調(diào)，伴隨大鼠記憶認知功能障礙，而芹菜素能夠增加NR2B的表達，與認知功能的改善相關。

我們的研究結果顯示，芹菜素能促進Caveolin-1表達，增加NR2B分泌，明顯改善腦缺血大鼠記憶認知功能。但是低劑量芹菜素提高Caveolin-1的作用不明顯，考慮芹菜素除了調(diào)控Caveolin-1表達外，尚通過調(diào)控其它因子表達，來改善腦缺血后大鼠認知功能的作用。我們的結果部分解釋了芹菜素對腦缺血大鼠認知功能障礙的改善作用及機制。然而，其潛在的作用機制仍有待進一步的探討。

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