孫戰(zhàn)強(qiáng)

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)重大傳染病之一[1]。隨著耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病疫情的快速上升，簡(jiǎn)單、快速和高效的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)技術(shù)成為迫切需求。基于耐藥突變基因的分子生物學(xué)方法因結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，仍不能完全滿足臨床需求[2]。而細(xì)菌學(xué)藥敏試驗(yàn)和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定成為抗結(jié)核新藥篩選[3]和個(gè)體化精準(zhǔn)治療的重要手段。近年來，基于氧化還原代謝原理并廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌增殖的方法，如阿爾瑪藍(lán)法、刃天青法、四唑鹽法等顯色方法，因簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉等優(yōu)勢(shì)在結(jié)核分枝桿菌的快速藥敏試驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用[4-7]。其中，四唑鹽法，尤其是新一代的水溶性四唑鹽3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT)因其背景值低、顯色快、試劑組合多變、價(jià)格低廉等特點(diǎn)使其更具有抗結(jié)核藥物高通量篩選和快速進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的潛能。通常，XTT通過細(xì)胞跨膜電子傳遞系統(tǒng)發(fā)生帶顏色變化的還原反應(yīng)，但XTT帶有較高的負(fù)電荷難以接近或透過細(xì)胞膜，顯色速度緩慢，一旦加入合適的中間電子受體進(jìn)行介導(dǎo)則可提高反應(yīng)速度[8-9]。前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)XTT/1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(mPMS)組合顯色系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱“XTT/mPMS”)可用于抗結(jié)核藥物高通量篩選[10]。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步深入檢測(cè)XTT/mPMS及其對(duì)照XTT/2-甲基-1,4-萘醌(mNQ)組合顯色系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱“XTT/mNQ”)用于分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)的性能，并對(duì)XTT/mPMS用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株快速藥敏測(cè)定的性能進(jìn)行評(píng)估。

材料和方法

1.材料：結(jié)核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 27294)和牛分枝桿菌BCG(ATCC 35745)由河南省胸科醫(yī)院提供，恥垢分枝桿菌mc2155為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。XTT、mPMS(1-methoxy-PMS)、mNQ(2-methyl-1,4-NQ)、刃天青、利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)等試劑購自美國Sigma公司；米氏7H9(Middlebrook 7H9)培養(yǎng)基和營養(yǎng)添加劑[油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(OADC)]購自美國BD公司；羅氏培養(yǎng)基購自上海成海公司；中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)為2009-1)。DH6000AB型恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器廠)、AM-9602A型酶標(biāo)儀(美國AMIS Medical公司)。

2.菌液制備：參考文獻(xiàn)[10]，比濁法配制1麥?zhǔn)綕舛?約1.5×108CFU/ml)的菌液。即：結(jié)核分枝桿菌H37Ra、牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至含0.05% Tween-80的7H9-S(7H9+OADC)液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待分枝桿菌生長到對(duì)數(shù)期后吸取菌液，用2～4 mm的玻璃珠漩渦振蕩2～5 min磨菌，比濁法調(diào)整菌液濃度至1麥?zhǔn)綕舛取?/p>

3.試劑制備：XTT、刃天青溶于1×磷酸鹽緩沖液(PBS)，mPMS溶于雙蒸水，mNQ溶于二甲基亞砜，XTT、mPMS和mNQ分別配制成0.2～48.0 mmol/L、0.2～12.8 mmol/L和0.2～12.8 mmol/L濃度。所有試劑用0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存(XTT于-20 ℃保存)備用。使用時(shí)各取10 μl單獨(dú)加樣或直接混合后再加樣。

4.XTT微量顯色檢測(cè)：將培養(yǎng)好的菌株用7H9培養(yǎng)基稀釋并調(diào)節(jié)濃度。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入菌懸液180 μl，分別加入中間電子受體和XTT各10 μl，37 ℃培養(yǎng)2～4 h后采用450 nm酶標(biāo)儀判讀。

5.XTT和中間電子受體(IEAs)濃度優(yōu)化：正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，XTT濃度0.0～2.4 mmol/L，mPMS濃度0.00～0.64 mmol/L，mNQ濃度0.0～6.4 mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間0～8 h，菌懸液濃度(0.0～3.0)×109CFU/ml，每個(gè)因子按5個(gè)水平分析。根據(jù)初步優(yōu)化結(jié)果，采用L25(25)矩陣法進(jìn)一步優(yōu)化，將XTT濃度0.00～0.25 mmol/L和IEAs濃度0.00～0.08 mmol/L設(shè)置5個(gè)水平，進(jìn)行上述的微量顯色檢測(cè)，最終獲得最佳組合濃度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

6.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)估：根據(jù)上述最佳優(yōu)化濃度，配制含XTT、mPMS、mNQ、XTT/mPMS和XTT/mNQ的7H9培養(yǎng)基，在96孔板中每孔80 μl，37 ℃培養(yǎng)8 d。將100 μl活化好的恥垢分枝桿菌菌懸液(1.5×108CFU/ml)，于每天分別加到上述含顯色試劑96孔板的未加過菌懸液的新孔中，再共同培養(yǎng)90 min后于紫外分光光度計(jì)判讀450 nm 波長處吸光度值(A450值)，持續(xù)8 d。

分別準(zhǔn)備適宜濃度的如下試劑溶液：XTT/mPMS、XTT/mNQ、XTT、mPMS、mNQ，每管40 μl分裝到數(shù)個(gè)500 μl EP管中，于4 ℃和25 ℃不同溫度條件儲(chǔ)存試劑。每隔5 d取出一管試劑，采用上述的XTT微量顯色法進(jìn)行長時(shí)間穩(wěn)定性檢測(cè)。

7.藥物干擾實(shí)驗(yàn)：96微孔板中用7H9液體培養(yǎng)基二倍稀釋法將常見抗結(jié)核藥物RFP、INH、EMB、Sm、Lfx等梯度稀釋成一系列的藥物濃度(500.00～15.62 μg/ml)。各試驗(yàn)孔再加入20 μl的XTT/mPMS或者XTT/mNQ顯色試劑混合物。37 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，每隔1 d在450 nm波長下檢測(cè)A450值。各試驗(yàn)孔重復(fù)3次。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖1 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)優(yōu)化試驗(yàn)

8.細(xì)胞毒性試驗(yàn)：在96微孔板中，20 μl XTT/mPMS或XTT/mNQ顯色試劑混合物與180 μl恥垢分枝桿菌菌液(1.5×105CFU/ml)37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，未加顯色試劑的菌液作為陽性對(duì)照，每隔6 h取10 μl培養(yǎng)液采用文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)。同樣的方法在牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中共培養(yǎng)18 d，每隔2 d對(duì)CFU計(jì)數(shù)檢測(cè)1次，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

9.XTT/mPMS顯色系統(tǒng)臨床評(píng)估：取藥敏試驗(yàn)結(jié)果明確(固體培養(yǎng)法)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株40株[敏感株(S)10株、單耐藥(DR)10株、耐多藥(MDR)10株、廣泛耐藥(XDR)10株]。對(duì)常見抗結(jié)核藥物的MIC檢測(cè)按照文獻(xiàn)[4]方法，略有修改。二倍稀釋法將抗結(jié)核藥物用每孔100 μl的 7H9-OADC 液體培養(yǎng)基于96微孔板中進(jìn)行梯度稀釋至如下濃度：128.00～0.25 μg/ml(RFP)、32.00～0.06 μg/ml(INH)，生長對(duì)照孔不加藥物。每孔加入100 μl菌液(0.5麥?zhǔn)綕岫?，?∶20稀釋)，37 ℃恒溫培養(yǎng)6～7 d，于第5天每孔加入20 μl的XTT/mPMS顯示試劑，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，顯色劑顏色由無色或淡黃色變化為深黃色或棕色，將阻止顏色變化孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度判為MIC值。如判讀不明顯的培養(yǎng)孔繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再判讀。刃天青MIC檢測(cè)方法同上，加入20 μl(濃度為0.1 g/L)顯示試劑后培養(yǎng)過夜，再如上述方法判讀(藍(lán)色變?yōu)樽霞t色)。藥敏折點(diǎn)值設(shè)置：RFP為0.5 μg/ml，INH為0.25 μg/ml。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPASS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)算檢測(cè)效能指標(biāo)，相關(guān)計(jì)算公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。線性判斷采用Excel 2007軟件中的線性回歸分析。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖2 不同菌株在XTT/IEAs顯色系統(tǒng)中顯色效果與與培養(yǎng)時(shí)間的線性關(guān)系

結(jié) 果

1.顯色劑的最優(yōu)配制比例：根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析，多因素與A450值的關(guān)系如圖1所示。發(fā)現(xiàn)在XTT與IEAs共培養(yǎng)中，mPMS的濃度達(dá)到0.04 mmol/L后，A450值達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，而mNQ的濃度達(dá)到0.04 mmol/L 后A450值開始降低。 XTT濃度達(dá)到0.2 mmol/L后A450值達(dá)到2.0，濃度0.25 mmol/L時(shí)A450值達(dá)到最高。因此，確定兩個(gè)顯色系統(tǒng)的最優(yōu)濃度為0.2 mmol/L的XTT和0.04 mmol/L的中間電子受體。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)圖3 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)檢測(cè)限線性范圍試驗(yàn)

2.顯色系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)間：對(duì)于恥垢分枝桿菌，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)的顏色A450值在前90 min內(nèi)呈線性(圖2a)，XTT/mNQ顯色系統(tǒng)的顏色A450值于60 min就達(dá)到平臺(tái)期(圖2b)。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，兩種顯色系統(tǒng)的顏色A450值到420 min仍保持線性(R2值均大于0.9)，但XTT/mPMS系統(tǒng)的信噪比更高，其A450值接近0.5(圖2)。

3.細(xì)胞增殖和敏感度分析：XTT/mPMS 系統(tǒng)的顏色A450值與結(jié)核分枝桿菌在2.4×107～7.5×108CFU/ml濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；對(duì)于恥垢分枝桿菌，僅在2.4×107～3.7×108CFU/ml呈線性關(guān)系(圖3a)。而XTT/mNQ系統(tǒng)具有更寬的線性檢測(cè)范圍(圖3b)。 此外，XTT/IEAs的顯色反應(yīng)強(qiáng)度存在種屬差異，即生長迅速的恥垢分枝桿菌顯色反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于其他分枝桿菌(圖3)。

圖a、b顯示XTT/IEAs顯色系統(tǒng)在7H9液體培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性；圖a顯示XTT/mPMS顯色系統(tǒng)，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統(tǒng)。圖c、d顯示XTT/IEAs顯色系統(tǒng)在儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。圖c為顯色系統(tǒng)在4 ℃儲(chǔ)存1個(gè)月， 圖d為顯色系統(tǒng)在25 ℃儲(chǔ)存1個(gè)月圖4 XTT/IEAs顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性試驗(yàn)

4.顯色系統(tǒng)穩(wěn)定性分析：通過不同溫度儲(chǔ)存條件的試劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，XTT/mPMS與7H9培養(yǎng)基共孵育時(shí)，其穩(wěn)定性至少保持7 d(圖4a)，但同樣條件下XTT/mNQ僅能維持2 d(圖4b)。導(dǎo)致XTT/mNQ系統(tǒng)穩(wěn)定性下降的原因是mNQ穩(wěn)定性差(圖4b)。由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)XTT/IEAs熱穩(wěn)定性較低，40 ℃下失效嚴(yán)重，因此未能得到有效的加速破壞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但得到了25 ℃常溫和4 ℃低溫儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。XTT/mPMS在4 ℃儲(chǔ)存條件下，顯色性能至少能持續(xù)30 d(圖4c)，而XTT/mNQ系統(tǒng)4 ℃存儲(chǔ)5 d后，基本失效(圖4c)。與單組分儲(chǔ)存方式相比，顯色試劑混合物在存儲(chǔ)中會(huì)發(fā)生少量的非細(xì)胞還原反應(yīng)。在25 ℃存儲(chǔ)條件下，XTT/mPMS存儲(chǔ)10 d后其顯色效能開始明顯下降，其原因是XTT開始失效(圖4d)。而在XTT/mNQ顯色系統(tǒng)中，由于mNQ穩(wěn)定性差，存儲(chǔ)到5 d后，其顯色性能已明顯降低到無法使用(圖4d)。

5.顯色系統(tǒng)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中XTT/mPMS與生長迅速的恥垢分枝桿菌共培養(yǎng)時(shí)，可使其到達(dá)生長穩(wěn)定期的時(shí)間延后12 h(圖5a)，但最終到達(dá)穩(wěn)定期的菌落數(shù)與對(duì)照組接近。在生長緩慢的牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中，XTT/mPMS使分枝桿菌到達(dá)生長穩(wěn)定期的時(shí)間延后1～2 d，但最終達(dá)到穩(wěn)定期的菌液濃度與對(duì)照組接近(圖5b，c)。因此XTT/mPMS對(duì)分枝桿菌的生長具有較低的細(xì)胞毒性。而XTT/mNQ系統(tǒng)與恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌共培養(yǎng)時(shí)，試驗(yàn)組比對(duì)照組均出現(xiàn)明顯的生長延遲，達(dá)到穩(wěn)定期后，菌液濃度也相對(duì)較低(圖5)。在3種分枝桿菌中，XTT/mPMS和XTT/mNQ均具有一定的細(xì)胞毒性作用，但XTT/mPMS的細(xì)胞毒性更低。

圖a為恥垢分枝桿菌，圖b為牛分枝桿菌，圖c為結(jié)核分枝桿菌圖5 XTT/IEAs 顯色系統(tǒng)細(xì)胞毒性分析

圖a顯示RFP干擾，圖b顯示INH干擾，圖c顯示Sm干擾，圖d顯示EMB干擾，圖e顯示Lfx干擾圖6 抗結(jié)核藥物對(duì)XTT/mPMS顯色系統(tǒng)的干擾檢測(cè)

6.XTT/IEAs受抗結(jié)核藥物干擾檢測(cè)：顯色系統(tǒng)在臨床使用中需要和抗結(jié)核藥物共培養(yǎng)，抗結(jié)核藥物自身所帶顏色可能會(huì)干擾顯色系統(tǒng)的正常判讀；此外，一些抗結(jié)核藥物可能會(huì)與顯色系統(tǒng)發(fā)生非細(xì)胞還原反應(yīng)。XTT/mPMS系統(tǒng)中，RFP的淡黃色可干擾XTT/mPMS的顯色讀數(shù)，這種干擾具有濃度依賴性，RFP濃度達(dá)到62.5 μg/ml以后，本底值已接近1.0，干擾嚴(yán)重(圖6a)。在INH中，高濃度的INH與顯色系統(tǒng)在共培養(yǎng)7 d以后，吸光度值接近1.0，干擾也比較嚴(yán)重(圖6b)。而Sm、EMB、Lfx等抗結(jié)核藥物均不與XTT/mPMS顯色系統(tǒng)發(fā)生非細(xì)胞還原反應(yīng)(圖6)。

7. XTT/IEAs臨床藥敏試驗(yàn)檢測(cè)：選擇藥敏試驗(yàn)結(jié)果已知(固體培養(yǎng)法)的40株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，同時(shí)采用XTT/mPMS和刃天青顯色系統(tǒng)進(jìn)行RFP和INH的MIC檢測(cè)，結(jié)果如表1、2。 XTT/mPMS的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與刃天青一致。在對(duì)RFP和INH兩種藥物的檢測(cè)中，XTT/mPMS顯色法的敏感度和特異度都達(dá)到90%以上。陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值也都比較高。在臨床試驗(yàn)中，XTT/mPMS組多在5～6 d獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，刃天青組多在6～7 d獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

討 論

四唑鹽廣泛用于動(dòng)物和微生物的藥敏試驗(yàn)、活性、增殖等檢測(cè)，以及藥物篩選。在這些應(yīng)用中，目前最常用的水溶性四唑鹽是XTT，該化合物可產(chǎn)生水溶性甲臢便于后續(xù)操作和觀察[6, 12]。一般而言，XTT顯色系統(tǒng)需搭配IEAs以提高反應(yīng)速度，作為該顯色反應(yīng)系統(tǒng)核心成分的IEAs，常見的有苯醌、萘醌、蒽醌和吩嗪硫酸甲酯類化合物[8]。前期工作中，筆者通過大量的篩選和測(cè)試，發(fā)現(xiàn)XTT/mNQ可以用于抗結(jié)核藥物高通量篩選[10]。因此，筆者預(yù)測(cè)該顯色系統(tǒng)在分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)中具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)的XTT/mNQ顯色系統(tǒng)因其穩(wěn)定性差，給臨床大規(guī)模使用造成諸多障礙。首先，XTT/mNQ只能用于分枝桿菌液體培養(yǎng)后的終點(diǎn)加樣檢測(cè)。其次，終點(diǎn)加樣步驟增加了實(shí)驗(yàn)操作人員的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。再次，XTT/mNQ顯色系統(tǒng)失效很快，只能是即用型試劑，既難以用于檢測(cè)試劑盒開發(fā)，也給臨床實(shí)際使用帶來巨大浪費(fèi)。筆者發(fā)現(xiàn)，造成XTT/mNQ顯色系統(tǒng)失效的主要原因是mNQ的穩(wěn)定性較差。而XTT/mPMS系統(tǒng)在7H9液體培養(yǎng)基37 ℃ 共培養(yǎng)條件下至少8 d內(nèi)仍然穩(wěn)定，表明其具有與分枝桿菌共培養(yǎng)的潛能。即便在25 ℃儲(chǔ)存條件，XTT/mPMS仍具有至少保持15 d的穩(wěn)定性，表明其具有開發(fā)成藥敏試驗(yàn)試劑盒的潛能。然而遺憾的是，筆者前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)XTT/mPMS會(huì)與7H9液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)添加劑OADC發(fā)生緩慢的顯色反應(yīng)[10]，使其在使用7H9+OADC培養(yǎng)基的分枝桿菌長期共培養(yǎng)快速藥敏試驗(yàn)中受限。但這提示，在臨床上XTT/mPMS可用于快速生長型非結(jié)核分枝桿菌的共培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)，以及不包含OADC成分的其他液體培養(yǎng)基的長期共培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)。

表1 XTT/mPMS顯色系統(tǒng)以固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)的耐藥檢測(cè)效能

表2 刃天青顯色系統(tǒng)以固體培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)的耐藥檢測(cè)效能

此外，盡管筆者發(fā)現(xiàn)高濃度RFP的淡黃色，以及高濃度的INH與XTT/mPMS長時(shí)間共培養(yǎng)時(shí)可與其發(fā)生緩慢的顯色反應(yīng)后的淡黃色，給XTT/mPMS顯色判讀帶來干擾，但實(shí)驗(yàn)中的藥物測(cè)試濃度遠(yuǎn)高于臨床藥敏試驗(yàn)的實(shí)際使用濃度，因此這一潛在的缺點(diǎn)并不影響臨床上的實(shí)際使用。

本研究中，XTT的顯色反應(yīng)原理是基于細(xì)菌的氧化還原反應(yīng)，這會(huì)依耐于菌株本身的活力。XTT顏色變化時(shí)間也高度依賴菌懸液濃度，濃度越高顯色越快。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，在同樣菌液濃度(麥?zhǔn)?號(hào))下，XTT在恥垢分枝桿菌培養(yǎng)液中顏色A450值達(dá)到平臺(tái)期需要60～90 min，而結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中至少需要420 min。這些現(xiàn)象共同表明，分枝桿菌的菌液濃度、種屬、細(xì)菌活力等因素會(huì)影響顯色反應(yīng)的速度和顯色強(qiáng)度。因?yàn)閄TT顯色強(qiáng)度具有試劑濃度依耐性，這提示在臨床實(shí)際使用中可通過適當(dāng)提高XTT和mPMS試劑的濃度和延長判讀時(shí)間來彌補(bǔ)以上缺陷。

在臨床評(píng)估中，筆者發(fā)現(xiàn)XTT/mPMS顯色系統(tǒng)和刃天青法的藥敏試驗(yàn)結(jié)果幾乎相同。相對(duì)于刃天青顯色法需要過夜再培養(yǎng)的情況，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)在加入試劑后2 h即可判讀結(jié)果，更具有明顯的優(yōu)勢(shì)。筆者亦發(fā)現(xiàn)在MIC肉眼判讀時(shí)，對(duì)于那些顏色反應(yīng)臨界點(diǎn)難以判讀的狀態(tài)，XTT/mPMS的淡黃色比刃天青的藍(lán)色、紫色混合顏色更容易判讀(數(shù)據(jù)未展示)。此外，在臨床測(cè)試的終點(diǎn)加樣中，出現(xiàn)了1例污染，刃天青法因需過夜培養(yǎng)，最終未能準(zhǔn)確判讀污染樣本的MIC值, 而XTT/mPMS終點(diǎn)加樣后只需2 h后即可判讀結(jié)果，規(guī)避了終點(diǎn)加樣操作引入污染的現(xiàn)象。

綜上，筆者對(duì)XTT/mPMS在分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)的配方優(yōu)化和性能進(jìn)行了系統(tǒng)性評(píng)估，首次闡明了XTT/mPMS顯色系統(tǒng)在分枝桿菌液體培養(yǎng)中的穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性、藥物干擾反應(yīng)特性，以及初步的臨床藥敏檢測(cè)效能。結(jié)果表明，XTT/mPMS顯色系統(tǒng)可以用于分枝桿菌快速藥敏或MIC檢測(cè)。本研究為臨床上使用簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效的分枝桿菌MIC快速檢測(cè)、適用于分枝桿菌MIC快速檢測(cè)共培養(yǎng)試劑的研發(fā)，以及基于細(xì)菌學(xué)的抗分枝桿菌藥物高通量篩選技術(shù)的運(yùn)用提供重要參考。

志謝感謝張朝寶同學(xué)在研究生階段參與了預(yù)試驗(yàn)和文獻(xiàn)檢索工作，感謝趙俊偉同學(xué)和玄松花同學(xué)給予了工作上的協(xié)助。感謝武漢醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科馬峻醫(yī)生及其相關(guān)同事對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)的支持和幫助。

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