唐虹，金鑫，閆曉娜

氯替潑諾是一種局部用新型的糖皮質(zhì)激素類藥物，是根據(jù)軟藥的原理研究設(shè)計(jì)出來(lái)的。軟藥是容易代謝失活的藥物，在藥物完成治療作用后，按預(yù)先設(shè)定的代謝途徑和可以控制的速率分解、失活并迅速排出體外，從而避免藥物的蓄積毒性。氯替潑諾易被水解為無(wú)活性的有機(jī)酸，當(dāng)用于眼睛后，迅速代謝為無(wú)活性的產(chǎn)物，降低了系統(tǒng)毒性，而抗炎作用比潑尼松龍更強(qiáng)。適用于治療眼睛角膜、結(jié)膜以及眼前部的炎癥，也可用于眼部手術(shù)后預(yù)防感染。文獻(xiàn)報(bào)道氯替潑諾在臨床上單獨(dú)應(yīng)用或與其他藥物合用，治療干眼癥、過(guò)敏性結(jié)膜炎、急性前葡萄膜炎及眼部術(shù)后抗炎等，是既有效又安全的“原位”產(chǎn)生療效的糖皮質(zhì)激素[1-6]。本研究將氯替潑諾口服給藥與滴眼給予含有氯替潑諾的滴眼劑后，比較不同給藥途徑血漿中氯替潑諾非活性代謝物PJ90與PJ91的藥動(dòng)學(xué)行為，以評(píng)價(jià)氯替潑諾給藥后的安全性。

1 材料與方法

1.1 儀器 HP1100型高效液相色譜，檢測(cè)器為紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；數(shù)據(jù)采集：安捷倫工作站(美國(guó)安捷倫公司)；進(jìn)樣器型號(hào)7725i Rheodyne(美國(guó)Rheodyne公司)；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XW-80A型渦流混合儀(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 試驗(yàn)制劑：氯替潑諾滴眼液，每劑每毫升含氯替潑諾5 mg，批號(hào)：060901-1；氯替潑諾膠囊，每粒含氯替潑諾50 mg，批號(hào)：060901-2；對(duì)照品：PJ90(批號(hào)：060901-3，純度：97%)，PJ91(批號(hào)：060901-4，純度：98.5%)。內(nèi)標(biāo)：分子式C18H14O10，純度：99.0%。以上藥物均由沈陽(yáng)華泰藥物研究有限公司提供。甲醇、乙腈均為色譜純，36%乙酸為分析純。

1.3 動(dòng)物 健康成年比格犬共6只，3雌3雄，體質(zhì)量為(10.3±0.5)kg，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(遼)2002-0002。

1.4 樣品采集 6只比格犬，試驗(yàn)前12 h禁食，給藥后可以自由飲水，仍需禁食4 h。滴眼給藥時(shí)每只眼滴入1滴(50 μL)，滴眼給藥時(shí)按壓內(nèi)眼角2 min，防止藥物進(jìn)入鼻淚管?？诜o藥時(shí)每只犬給藥1粒(50 mg)。

采樣時(shí)間點(diǎn)如下：給藥前，給藥后15、30、45、60、90 min，2、3、4、6、8、12、24 h由后肢靜脈采血1 mL；全血樣品采集后即刻移入肝素化玻璃離心管內(nèi)，以3 000 r/min離心10 min，將離心后的上層血漿移入另一干凈血漿樣品管內(nèi)，-70 ℃冷凍保存待測(cè)。

1.5 試驗(yàn)條件 反相高效液相色譜柱：Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，北京迪馬公司；保護(hù)柱型號(hào)：DL-II YWG-C18，10 mm×4.0 mm，天津市色譜科學(xué)技術(shù)公司；流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水∶36%乙酸(體積比為50∶6∶56∶0.5)，流速為1.3 mL/min，色譜柱溫度：25 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

1.6 血漿樣品預(yù)處理 精密移取血漿樣品200 μL，依次精密移取甲醇10 μL，內(nèi)標(biāo)溶液C18H14O10甲醇10 μL，內(nèi)標(biāo)濃度為15 mg/L。將溶液渦流混勻后，精密移取乙腈500 μL，渦流混合1 min，以3 000 r/min離心10 min。將離心后的樣品上清液移入另一試管中，移取后的上清液在室溫下，用氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相100 μL復(fù)溶，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.7 專屬性 精密移取200 μL空白比格犬血漿，依上述血漿樣品預(yù)處理操作，不加入內(nèi)標(biāo)，所得樣品20 μL進(jìn)行HPLC-UV分析，獲得色譜圖1a(見(jiàn)封三)；空白血漿分別加入濃度為1.5 mg/L的PJ90、1.0 mg/L的PJ91標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述血漿樣品預(yù)處理操作，獲得色譜圖1b(見(jiàn)封三)。PJ90、PJ91和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.2、7.0、10.2 min。1只比格犬口服給予氯替潑諾0.75 h后的血漿樣品，依上述血漿樣品預(yù)處理操作，獲得色譜圖1c(見(jiàn)封三)。由所得色譜圖可見(jiàn)，比格犬空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定結(jié)果，在PJ90、PJ91和內(nèi)標(biāo)的出峰位置均無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾峰出現(xiàn)。

1.8 定量限 根據(jù)相關(guān)規(guī)定[7]，定量下限要求能測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期時(shí)未知樣品中的藥物濃度，或者能夠檢測(cè)出峰濃度1/10～1/20的藥物濃度。本項(xiàng)試驗(yàn)中的血漿最低定量濃度分別為0.027 mg/L和0.018 mg/L，信噪比均>10，依據(jù)上述血漿樣品預(yù)處理操作，平行制備3樣本，制備三批定量下限樣品，PJ90和PJ91定量下限批內(nèi)精密度RSD分別為：10.4%和9.8%；PJ90和PJ91定量下限批間精密度RSD分別為：12.9%和15.2%；PJ90和PJ91準(zhǔn)確度為：94.2%和95.3%。符合試驗(yàn)要求及相關(guān)規(guī)定。

1.9 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密移取200 μL空白比格犬血漿，準(zhǔn)確加入PJ90和PJ91的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL，分別制備相當(dāng)于PJ90血漿濃度0.027，0.067 5，0.135，0.45，1.5，3.0 mg/L和PJ91血漿濃度0.018，0.045，0.09，0.3，1.0，2.0 mg/L的血漿樣品，依據(jù)上述血漿樣品預(yù)處理操作，每一濃度平行制備3樣本，準(zhǔn)確進(jìn)樣20 μL。橫坐標(biāo)為血藥濃度，縱坐標(biāo)分別為PJ90或PJ91與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，權(quán)重w=1/x2。所得PJ90直線回歸方程為：y=5.219×10-1x-4.423×10-3，r=0.997 8；所得PJ91直線回歸方程為：y=3.29×10-1x+6.172×10-3，r=0.999 1。結(jié)果表明，PJ90血藥濃度在(0.027～3.0)mg/L內(nèi)為線性關(guān)系良好，定量下限為0.027 mg/L；PJ91血藥濃度在(0.018～2.0)mg/L內(nèi)為線性關(guān)系良好，定量下限為0.018 mg/L。

1.10 精密度和回收率 (1)血漿精密度：精密移取200 μL空白比格犬血漿，依照上述血漿樣品預(yù)處理操作，準(zhǔn)確制備低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品，每一個(gè)濃度的血漿樣品平行制備6樣本，相當(dāng)于PJ90血藥濃度分別為：0.067 5，0.45，2.4 mg/L，相當(dāng)于PJ91血藥濃度分別為：0.045，0.30，1.6 mg/L。根據(jù)以上濃度連續(xù)制備三批質(zhì)量控制樣品，按照當(dāng)批樣品隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度。采用同一批質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度，計(jì)算本法的批內(nèi)精密度RSD，PJ90為：2.8%、7.2%、7.0%，PJ91為：5.1%、5.8%、7.8%；根據(jù)連續(xù)三批的質(zhì)量控制樣品結(jié)果，計(jì)算本法的批間精密度RSD，PJ90為：6.1%、9.5%、8.5%，PJ91為：4.5%、7.4%、14.7%。

(2)血漿回收率：用空白血漿配制,分別配置低、中、高三個(gè)濃度樣本，相當(dāng)于PJ90血藥濃度分別為：0.067 5、0.45、2.4 mg/L，相當(dāng)于PJ91血藥濃度分別為：0.045、0.30、1.6 mg/L。按上述血漿樣品預(yù)處理后進(jìn)樣。將空白比格犬血漿樣品按上述血漿樣品預(yù)處理，不加入PJ90、PJ91及內(nèi)標(biāo)，移取上清溶液后，再分別加入PJ90和PJ91三個(gè)濃度等量的樣品及內(nèi)標(biāo)溶液，以此為標(biāo)準(zhǔn)與同等濃度質(zhì)量控制樣品比較，計(jì)算兩組峰面積比值，獲得PJ90和PJ91提取回收率。PJ90三個(gè)濃度的血漿樣品提取回收率分別為：98.8%、97.0%、99.1%，PJ91三個(gè)濃度的血漿樣品提取回收率分別為：95.4%、98.6%、99.3%。

1.11 穩(wěn)定性 本試驗(yàn)分別考察了PJ90和PJ91用高、中、低已知濃度的血漿質(zhì)控樣品經(jīng)三次冷凍-解凍循環(huán)后的穩(wěn)定性，樣本在-70 ℃冷凍保存穩(wěn)定，血漿樣品經(jīng)反復(fù)3次凍融循環(huán)后穩(wěn)定，提取后的血漿樣品在室溫放置24 h后穩(wěn)定，血漿樣品融化后放置于室溫2 h后再提取、進(jìn)樣，該樣品穩(wěn)定，樣本在-70 ℃保存長(zhǎng)期放置1個(gè)月穩(wěn)定。結(jié)果表明，在上述條件下，PJ90和PJ91保持穩(wěn)定(RE值在±15 %內(nèi))。

2 結(jié)果

2.1 平均血藥濃度-時(shí)間曲線 6只比格犬分別經(jīng)不同途徑給藥后，滴眼給藥血漿中未測(cè)到藥物濃度，口服給藥后，不同時(shí)刻PJ90和PJ91平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

圖2 單次口服給藥后PJ90和PJ91的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 氯替潑諾口服給藥后，對(duì)其非活性代謝物PJ90和PJ91進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的進(jìn)算，計(jì)算軟件為DAS 2.0，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

本研究檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[8-9]并加以改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床給藥方式，考察糖皮質(zhì)激素類藥物氯替潑諾不同給藥途徑在比格犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)行為，為臨床用藥安全提供參考。

表1 單次口服給藥后PJ90和PJ91的主要藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)

文獻(xiàn)報(bào)道研究氯替潑諾犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為時(shí)，犬口服給予氯替潑諾5 mg/kg后，只測(cè)到了代謝物，濃度約為0～200 μg/L，而未測(cè)到原形藥物[9]。本實(shí)驗(yàn)室已完成的氯替潑諾家兔眼內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)[10]亦證實(shí)無(wú)法測(cè)得原形藥物，故本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)代謝物PJ90和PJ91的血藥濃度來(lái)考察給藥后的安全性。犬給藥劑量定為5 mg/kg，由于所購(gòu)比格犬體質(zhì)量相當(dāng)，均為10 kg左右，故將50 mg氯替潑諾填膠囊后，每犬給藥1粒(約相當(dāng)于給藥5 mg/kg)，并保證給藥時(shí)膠囊完整。氯替潑諾為原位生效藥物，給藥后迅速代謝為無(wú)活性的代謝物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)氯替潑諾比格犬口服給藥后的代謝物PJ90和PJ91的濃度進(jìn)行了測(cè)定，并計(jì)算了此兩種代謝物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，可作為參考。

滴眼給藥時(shí)，考慮到滴眼液可能會(huì)通過(guò)鼻淚管進(jìn)入口腔，不排除通過(guò)鼻黏膜吸收入血及通過(guò)口腔口服后吸收的情況，故在滴眼給藥時(shí)按壓內(nèi)眼角2 min，盡量避免藥物進(jìn)入鼻淚管。

通過(guò)6只成年健康比格犬不同給藥途徑的藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)考察，氯替潑諾即使全身給藥(口服)后，比格犬體內(nèi)的代謝物PJ90和PJ91血藥濃度依然很低，約為0～400 μg/L，可保證氯替潑諾臨床用藥的安全性。通過(guò)本試驗(yàn)可證實(shí)，氯替潑諾雖然是糖皮質(zhì)激素類藥物，但由于其原位生效的作用機(jī)制，即使在臨床上兒童給藥也是可以保證其安全性的。

[1] 梁四妥，張西寧，龐彥英，等.氯替潑諾聯(lián)合環(huán)孢素滴眼液治療干燥綜合征型干眼的療效觀察[J].眼科新進(jìn)展，2014，34(11):1073-1076.

[2] 林靜，趙桂秋，高昂，等.依碳酸氯替潑諾與雙氯芬酸鈉滴眼液對(duì)季節(jié)性過(guò)敏性結(jié)膜炎療效比較[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2014，29 (2):127-128.

[3] 方曉珊，楊鴻昌，余杰克，等.氯替潑諾妥布霉素和妥布霉素地塞米松在超聲乳化吸除術(shù)后抗炎效果的比較[J].國(guó)際眼科雜志，2015，15(5):887-889.

[4] 曹芃，劉李平，練海東，等.妥布霉素地塞米松聯(lián)合氯替潑諾治療前葡萄膜炎的療效分析[J].國(guó)際眼科雜志，2011，11(9):1648-1649.

[5] 曾鳳，盧亞梅，周元清，等.氯替潑諾治療中重度干眼抗炎作用的臨床分析[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41(5):486-489.

[6] 程金偉，魏銳利，李由.氯替潑諾控制眼部炎癥的安全性和有效性的薈萃分析(英文)[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2003，22(5):259-263.

[7] 藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].[2014-05-13].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/101019.html.

[8] Yasueda S, Higashiyama M, Shirasaki Y, et al.An HPLC method to evaluate purity of a steroidal drug, loteprednol etabonate[J]. J Pharm Biomed Anal，2004，36(2):309-316.

[9] Hochhaus G, Chen LS, Ratka A, et al.Pharmacokinetic characterization and tissue distribution of the new glucocorticoid soft drugloteprednol etabonate in rats and dogs[J]. J Pharm Sci，1992，81(12):1210-1215.

[10]李紅霞，金鑫，劉冠.等.氯替潑諾滴眼劑兔眼內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10(35):452-454.