肖晗, 王璐畇, 趙旻, 陳琪, 段舜山

暨南大學(xué)水生生物研究中心, 水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510632

1 前言

赤潮(Harmful Algal Blooms, HABs)是國際社會(huì)共同關(guān)注和急需研究解決的海洋環(huán)境問題之一, 探索經(jīng)濟(jì)有效的防治方法對于保護(hù)海洋環(huán)境質(zhì)量、保障養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展以及維護(hù)人類健康均具有重要意義[1]。錐狀斯氏藻隸屬甲藻門(Pyrrophyta)斯氏藻屬(Scrippsiella Baleth & Loeblich),細(xì)胞長為 18—30μ m, 是一種世界廣布性赤潮藻類,其赤潮在世界各地海域時(shí)有發(fā)生,在我國東南沿海廣泛分布,同時(shí)也是我國南海重要的赤潮生物[2]。2000年起我國南海海域接連發(fā)生多起大規(guī)模錐狀斯氏藻赤潮[3-5], 錐狀斯氏藻赤潮已經(jīng)成為我國主要的有害赤潮之一。錐狀斯氏藻在遇到不良環(huán)境時(shí)形成孢囊, 當(dāng)遇到合適生長條件就會(huì)重新萌發(fā)并爆發(fā)赤潮[3]。錐狀斯氏藻雖然無毒, 但是能夠通過大量的聚集, 造成水體缺氧, 從而導(dǎo)致水生動(dòng)物的機(jī)械性窒息死亡, 進(jìn)而造成了水質(zhì)的惡化, 危及到海洋生態(tài)系統(tǒng)的安全[6]。赤潮爆發(fā)嚴(yán)重影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能, 并給漁業(yè)造成巨大的損失[7]。

目前國內(nèi)外尚未找到合理有效的治理方法, 均以預(yù)防為主, 治理為輔的策略。目前治理赤潮的方法主要有三種, 分別是物理法[8,9]、化學(xué)法[10-13]、生物法[14]。然而, 物理方法成本高、效率低, 化學(xué)方法容易產(chǎn)生二次污染[15], 真正可用于實(shí)際的方法并不多?；凶饔迷淼陌l(fā)現(xiàn)為赤潮的防治提供了新的研究思路。高等植物能產(chǎn)生各種次級代謝產(chǎn)物通過根、枝葉、凋落物釋放到環(huán)境中[16],來影響周圍其他植物的生長, 從而為自身競爭到更多的光照、水分和礦物質(zhì)[17]。大型沉水植物為優(yōu)勢種的水生態(tài)系統(tǒng)中通常具有更高的生物多樣性和更清澈的水質(zhì), 在浮游植物為優(yōu)勢種的水生態(tài)系統(tǒng)中往往具有低的生物多樣性和糟糕的水質(zhì)[18]。目前, 利用化感作用控制水華已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[16,19]。有研究發(fā)現(xiàn)某些大型水生植物如金魚藻[20]、黑藻[20]、水浮蓮[21]、眼子菜[22]、石莼[23]、紅毛藻[24]、狐尾藻[19]對某些藻類具有抑制作用。但是, 關(guān)于利用化感作用控制海洋赤潮藻的研究還較少, 亦少見關(guān)于海草對赤潮藻生長抑制作用的報(bào)道。

海草床生態(tài)系統(tǒng)是典型海洋生態(tài)系統(tǒng)[25]。除了北冰洋沿岸,全世界幾乎所有的海岸都有海草分布[26]。海草草甸是生產(chǎn)力最高的海洋生態(tài)系統(tǒng)之一[27], 一些海草植物能夠產(chǎn)生化感物質(zhì), 對其他植物產(chǎn)生抑制效應(yīng)。例如, 曾經(jīng)大量生長過波喜蕩(Posidonia oceanica)的海區(qū)人工移植其他海草種很難成活, 而重新移植波喜蕩, 建植的成功率最高達(dá)到 98%。Harrison[28]利用 14C示蹤法發(fā)現(xiàn)大葉藻(Zostera marina)葉片水提物降低了其附生硅藻的光合作用效率。然而, 尚不清楚海菖蒲浸提物是否能夠抑制赤潮藻的生長。為此, 本文研究了海菖蒲干粉三種提取物對典型赤潮藻錐狀斯氏藻生長的影響, 以期為進(jìn)一步利用海草植物資源提高近海水域的環(huán)境生態(tài)效益提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 赤潮藻

實(shí)驗(yàn)所用藻種錐狀斯氏藻(S. trochoidea)由暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種室提供。赤潮藻采用改進(jìn)過的 f/2培養(yǎng)基[29]靜置培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為100 μmol·m2·s-1, 光暗比 12L：12D, 培養(yǎng)溫度為(23±1) ℃,鹽度為30, 起始pH為8.0±0.02。每天搖晃赤潮藻三次防止其貼壁生長。藻細(xì)胞密度用C6流式細(xì)胞儀測定(BD AccuriC6, USA)。在實(shí)驗(yàn)前三天將對數(shù)期藻細(xì)胞接種到高溫滅菌的培養(yǎng)基中以適應(yīng)生長環(huán)境。

2.1.2 海草植物

海菖蒲(Enhalus acodoides)采集于中國海南省陵水縣新村灣(E109°59'34, N18°23'59)。

2.2 方法

2.2.1 海菖蒲干粉的制備

新鮮海菖蒲葉片采集出水后迅速用蒸餾水和毛刷刷去其表面附著的藻類與其他生物, 然后放入烘箱中 60 ℃烘干至恒重。烘干后的海草用研缽研磨成粉末, 過100目篩網(wǎng), 4 ℃保存待用。

2.2.2 海菖蒲干粉浸提液母液制備

用電子天平準(zhǔn)確稱取40 g海草植物干粉, 加入容量為3000 mL且經(jīng)過高溫蒸汽滅菌過的玻璃燒杯中, 加入2000 mL人工海水。用無菌封口膜包扎瓶口放入恒溫水浴電磁攪拌鍋中, 調(diào)制中等轉(zhuǎn)速, 25 ℃浸提48 h。浸提液離心(5000 rpm, 15 min), 取上清液。上清液由Millipore水系0.22 μm濾膜過濾去除微生物,得到實(shí)驗(yàn)用浸提母液, 濃度為20 g·L-1。提取液4 ℃保存待用。過濾過程在超凈工作臺(tái)中嚴(yán)格無菌進(jìn)行。

2.2.3 海菖蒲乙醇與正己烷粗提物制備

用電子天平分別準(zhǔn)確稱取 10 g海草植物干粉,分別加入兩個(gè)容量為 500 mL經(jīng)過高溫蒸汽滅菌過的玻璃錐形瓶中, 分別加入 300 mL乙醇正己烷浸漬提取(10d, 室溫23 ℃)。將浸提液經(jīng)Millipore有機(jī)相0.22 μm 濾紙過濾, 濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋干(35℃), 濃縮至1—2 mL。將濃縮液用氮?dú)獯蹈? 分別得到乙醇提取物與正己烷粗提物。

2.2.4 海菖蒲干粉水體物對錐狀斯氏藻生長的抑制實(shí)驗(yàn)

蒸汽滅菌過的500 mL三角玻璃瓶裝200 mL培養(yǎng)液。錐狀斯氏藻培養(yǎng)體系中海菖蒲水提液濃度設(shè)置為0、0.1、0.5、1和2.5 g·L-1, 每個(gè)濃度作三組平行?？瞻讓φ战M中不添加海菖蒲提取液, 加相同體積的滅菌人工海水。錐狀斯氏藻起始培養(yǎng)濃度分別為1×103cells·mL-1, 培養(yǎng)時(shí)間為8天。從接種開始每隔24小時(shí)取樣2 mL藻液用1%甲醛固定之后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞密度并計(jì)算抑制率。

赤潮藻抑制率計(jì)算公式如下[30]

其中IR為相對抑制率;N為浸提物處理組的藻密度(cells·mL-1);N0為空白對照組藻密度(cells·mL-1)。

2.2.5 海菖蒲乙醇粗提物與正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制實(shí)驗(yàn)

海菖蒲乙醇粗提物與正己烷粗提物對錐狀斯氏藻抑制實(shí)驗(yàn)采用無菌 48孔板培養(yǎng), 培養(yǎng)體系為 2 mL, 將海草粗提物用 2.5‰DMSO 復(fù)溶, 粗提物濃度設(shè)置為 0、6.25、12.5、25和 50 mg·L-1。每個(gè)濃度作三組平行。空白對照組中不添加海菖蒲粗提物,加相同體積的滅菌人工海水和對應(yīng)濃度的DMSO。錐狀斯氏藻起始培養(yǎng)濃度為1×103cells·mL-1培養(yǎng)時(shí)間為12天。從接種開始每隔48小時(shí)取樣100 μL藻液用 1%甲醛固定之后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞密度并計(jì)算抑制率。

2.2.6 二甲基亞砜作為助溶劑對錐狀斯氏藻生長的影響

用二甲基亞砜作為助溶劑, 分別用不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO對五種赤潮藻進(jìn)行劑量效應(yīng)測試, 設(shè)置空白、0.50%、1%、1.50%、2%、2.50%、3%、3.50%、4%、4.50%(v/v)共計(jì)10個(gè)濃度梯度, 每24 h測定一次藻細(xì)胞在680 nm波長處的吸光值(多孔板法), 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算出無可觀察效應(yīng)劑量(No observed effect level, NOEL)。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用FlowJo軟件完成流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析。使用GraphPad Prism 7和Microsoft Excel 2016軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。通過單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)處理組與對照組之間的差異顯著性,當(dāng)P＜0.05時(shí), 表示差異顯著,P＜0.01時(shí), 表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 海菖蒲干粉水提液對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖1-a為不同濃度海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻生長的影響呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。相比空白對照組,0.1 g·L-1處理組在第四天開始對錐狀斯氏藻有抑制作用。0.5、1和2.5 g·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖1 海菖蒲干粉水提液對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度;b.抑制率; 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,n=3)Fig 1 Effects of Enhalus acoroides dry powder water extracts on the growth of S. trochoidea (a. algal density; b.IR; mean±SD, n=3)

圖1-b為不同濃度海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。2.5 g·L-1處理組在第8天達(dá)到最高抑制率95.34%。1 g·L-1和2.5 g·L-1處理組在培養(yǎng)的第一天的抑制率分別為43.36%和 48.08%, 0.5、1、2.5 g·L-1處理組均有顯著抑制作用(P＜0.05)。8 天內(nèi), 0.1、0.5、1 和 2.5 g·L-1處理組最高抑制率為分別為42.2%、82.47%、95.07%和95.34%。

3.2 海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖2-a為不同濃度海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。相比空白對照組, 6.25 mg·L-1處理組對錐狀斯氏藻無顯著抑制作用(P＞0.05)。12.5、25和 50 mg·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。抑制效果隨海菖蒲濃水提液度升高而升高。

圖2 海菖蒲干粉乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度; b.抑制率; 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差, n=3)Fig 2 Effects of Enhalus acoroides ethanol phase extracts on the growth of S. trochoidea (a. algal density; b. IR;mean±SD, n=3)

圖2-b為不同濃度海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。12.5 mg·L-1處理組在第 12天達(dá)到最高抑制率78.55%。12.5、25和50 mg·L-1處理組在培養(yǎng)的第一天的抑制率分別為 20.97%、32.26%和29.84%。12天內(nèi), 6.25、12.5、25 和 50 mg·L-1處理組最高抑制率為分別為6.92%、78.55%、56.4%和75.09%。

3.3 海菖蒲干粉正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖3-a為不同濃度海菖蒲正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。相比空白對照組, 6.25 mg·L-1與12.5 mg·L-1處理組顯著促進(jìn)了錐狀斯氏藻的生長(P＜0.05)。25 mg·L-1和 50 mg·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。抑制效果隨海菖蒲濃正己烷粗提物濃度度升高而增強(qiáng)。

圖3 海菖蒲干粉正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度; b.抑制率; 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差, n=3)Fig 3 Effects of Enhalus acoroides hexane phase extracts on the growth of S. trochoidea (a.algal density; b.IR;mean±SD, n=3)

圖3-b為不同濃度海菖蒲正己烷粗提物對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。50 mg·L-1處理組在第12天達(dá)到最高抑制率58.28%。25 mg·L-1和 50 mg·L-1處理組在培養(yǎng)的第一天的抑制率分別為27.5%和31.25%。12天內(nèi), 6.25、12.5、25和50 mg·L-1處理組最高抑制率為分別為5.29%、12.58%、32.45%和58.28%。

3.4 二甲基亞砜作為助溶劑對錐狀斯氏藻生長的影響

不同體積分?jǐn)?shù)二甲基亞砜對錐狀斯氏藻生長的影響如圖4所示,當(dāng)二甲基亞砜(DMSO)的體積分?jǐn)?shù)≤2.5‰時(shí),對錐狀斯氏藻的生長影響與對照組相比差異不顯著(P＞0.05),而 DMSO的體積分?jǐn)?shù)≥3‰時(shí),對錐狀斯氏藻的生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P＜0.05),因此實(shí)驗(yàn)中助溶劑DMSO的體積分?jǐn)?shù)選定為2.5‰。

圖4 二甲基亞砜對錐狀斯氏藻藻密度的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差, n=3)Fig 4 Effects of DMSO on the algal density of S. trochoidea

4 討論

本研究采用歐盟和美國國家環(huán)保署藻類生長抑制試驗(yàn)(Algal Growth Inhibition Test)標(biāo)準(zhǔn)方法, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可反映海菖蒲干粉提取物對錐狀斯氏藻生長抑制效應(yīng)。

海菖蒲干粉水浸液(圖1)在很低的濃度下就能影響錐狀斯氏藻生長, 抑藻效果與濃度正相關(guān), 說明海菖蒲中部分水溶性的物質(zhì)具有抑制錐狀斯氏藻的能力, Grignon-Dubois的研究也支持了我們的結(jié)果,研究發(fā)現(xiàn)大葉藻的水提物和甲醇提取物在很低的濃度下就對鏈狀亞歷山大藻產(chǎn)生了強(qiáng)烈抑制作用[31],其中水溶性酚類物質(zhì)對抑制鏈狀亞歷山大藻生長起到主要的作用。乙醇粗提物(圖2)對錐狀斯氏藻起到了無顯著抑制效應(yīng)(p＞0.05)和顯著的抑制效應(yīng)(p＜0.05)兩種結(jié)果, 抑制效果與濃度成正相關(guān), Shu-Hua Qi[32]從海菖蒲乙醇提取物中分離出11種物質(zhì),其中黃酮和類固醇具有抗海洋細(xì)菌的活性。正己烷粗提物(圖3)出現(xiàn)了“低促高抑”的雙重濃度效應(yīng), 說明海菖蒲正己烷粗提物中同時(shí)存在促進(jìn)錐狀斯氏藻生長和抑制錐狀斯氏藻生長的物質(zhì), “低促高抑”現(xiàn)的存在象表明化感物質(zhì)在環(huán)境中的濃度是決定其起作用的關(guān)鍵因素, 孫志偉[33]的研究也支持我們的結(jié)果, 研究發(fā)現(xiàn)紅樹植物提取物對赤潮藻也有抑制效應(yīng), 并出現(xiàn)了“低促高抑”的效應(yīng)。因此海菖蒲粗提物中可能存在三類物質(zhì), 一類是可以促進(jìn)藻類生長的物質(zhì), 一類是可以抑制藻類生長的物質(zhì), 一類是對藻類生長不起作用的物質(zhì), 最終表現(xiàn)出來的效果是這三類物質(zhì)共同作用的結(jié)果[33]。如果促進(jìn)藻類生長的物質(zhì)占優(yōu)勢, 則表現(xiàn)出促進(jìn)作用, 如果抑制藻類生長的物質(zhì)占優(yōu)勢, 則表現(xiàn)出抑制作用。

研究結(jié)果表明海菖蒲三種提取物均對錐狀斯氏藻產(chǎn)生了不同程度的的抑制作用。海菖蒲生長在在近岸沿海潮下帶水域, 并能夠長期穩(wěn)定生長[34], 具有持續(xù)釋放化感物質(zhì)的潛力。海菖蒲海草床還能為許多物種提供庇護(hù)場所, 提高近岸水域生物多樣性[35], 將其作為生物防治赤潮的物種具有成本低, 無二次污染的風(fēng)險(xiǎn), 具有物理方法和化學(xué)方法所不具有的優(yōu)越性,因此, 海菖蒲具有生物防治錐狀斯氏藻赤潮的潛力,其具有應(yīng)用于近海水體富營養(yǎng)化的治理和開發(fā)新型抑藻劑的潛力。

本研究均使用一次性培養(yǎng), 而且水提液抑制實(shí)驗(yàn)在較小的三角瓶中進(jìn)行,有機(jī)相粗提物實(shí)驗(yàn)在多孔版中進(jìn)行。因此, 實(shí)驗(yàn)條件尚不能與自然海區(qū)的環(huán)境條件相吻合, 可能也會(huì)造成一定的瓶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)海菖蒲中不同極性提取物抑藻能力不同, 抑藻能力隨極性增強(qiáng)而增強(qiáng)。但是具體是什么物質(zhì)在起作用目前還不太明確, 有待進(jìn)一步研究。

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