賈占偉，何強(qiáng)，張玉波，韓海霞

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科，河北 石家莊 050000)

當(dāng)今社會(huì)，噪聲污染已成為了人類聽(tīng)力健康的主要?dú)⑹种?。噪音?huì)傷害耳朵感聲器官(耳蝸)的感覺(jué)發(fā)細(xì)細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)人類聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)造成不同程度的破壞。其原理推斷為噪聲可以造成耳蝸微循環(huán)障礙[1]。機(jī)體的感覺(jué)發(fā)細(xì)細(xì)胞一旦受到傷害，則永遠(yuǎn)不會(huì)復(fù)原，長(zhǎng)時(shí)間的傷害會(huì)形成噪音性耳聾。目前治療耳聾的方法主要有中醫(yī)治療、西醫(yī)治療及儀器治療。近年來(lái)，中醫(yī)針灸被越來(lái)越多的用于耳聾的治療。本研究從耳蝸基底膜毛細(xì)胞毛細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、耳蝸相關(guān)凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)為切入點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn), 采用RT-PCR的方法，研究針刺聯(lián)合前列地爾對(duì)噪音性大鼠耳蝸組織VEGF、Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)的影響及其作用機(jī)制, 為臨床應(yīng)用針刺聯(lián)合前列地爾治療耳聾疾病患者提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和分組 Wistar大鼠(SPF級(jí))32只，體質(zhì)量(200±15)g，無(wú)中耳炎， 由河北省藥品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)為SCXK(冀)2004-1-005。按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組：空白對(duì)照組、模型組、前列地爾治療組和針刺聯(lián)合前列地爾治療組，每組8只。

1.1.2 儀器 隔音室，北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供；81150A 脈沖函數(shù)任意噪聲發(fā)生器(是德科技有限公司)；A-K200功率放大器(蘇州景通儀器有限公司)；倍頻程噪聲光盤(北京中醫(yī)藥大學(xué)聽(tīng)力研究室)；TES-1350A型聲級(jí)計(jì)(蘇州景通儀器有限公司)；聽(tīng)覺(jué)腦干電位儀(Waters，美國(guó))；FDH-39型耳機(jī)(蘇州景通儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(蘇州景通儀器有限公司)。

1.1.3 試劑 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京弘博康醫(yī)藥科技有限公司)，氫化可的松注射液，(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)0503171)；Real-Time PCR試劑盒(大連TaKaRa 公司)；Anti-Bax:(Abcam 公司，貨號(hào):ab115193)；Anti-Bcl-2(Aabcam 公司，貨號(hào):ab117115)；EDTA(北方百勝國(guó)際生物技術(shù)有限公司)；免疫組化SABC試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；DAB(上海圖赫實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 除對(duì)照組外，將其余3組大鼠置于小籠內(nèi)(30 cm×30 cm×100 cm)，每籠2只，放入暴露艙(1.0 m×0.5 m×1.0 m)，利用81150A 脈沖函數(shù)任意噪聲發(fā)生器發(fā)聲。噪音頻率3 000 Hz，聲強(qiáng)116 dB 聲壓級(jí)(sound pressure level，SPL)。大鼠暴露范圍內(nèi)聲揚(yáng)不均勻度為±2 dB。每天暴露8 h，共暴露7 d。造模前及造模結(jié)束后，檢測(cè)各組大鼠聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response，ABR)聽(tīng)力閾值。檢測(cè)方法相關(guān)參考文獻(xiàn)[2]。

1.2.2 治療方法 造模完成后, 空白組與模型組每天灌胃12 mL/kg生理鹽水。從暴露前1 d至暴露后20 d，前列地爾組給予實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃處理(前列地爾，6 mg·kg-1·d-1，每天1次，共28 d；針刺聯(lián)合組在前列地爾治療的基礎(chǔ)上，選三焦經(jīng)腧穴“翳風(fēng)”(雙)、“外關(guān)”(雙)進(jìn)行針刺處理，每天1次，每次留針25 min，共28 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)耳蝸毛細(xì)胞VEGF染色：取各組大鼠耳蝸，10%甲醛固定，EDTA 脫鈣，用不同濃度的酒精逐級(jí)脫水處理24 h，石蠟包埋，切片。采用ABC 法進(jìn)行染色，觀察記錄；(2)耳蝸組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)：取各組大鼠耳蝸，-70 ℃冰箱保存。將其充分研磨，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法，進(jìn)行耳蝸組織Bcl-2 mRNA表達(dá)的檢測(cè)；(3)耳蝸組織Bax mRNA的表達(dá)：取各組大鼠耳蝸，-70 ℃冰箱保存。將其充分研磨，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法，進(jìn)行耳蝸組織Bax mRNA表達(dá)的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ABR聽(tīng)力閾值

由表1可見(jiàn)，造模結(jié)束后，各組大鼠ABR聽(tīng)力閾值均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。且造模3組大鼠ABR聽(tīng)力閾值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

表1 各組大鼠ABR聽(tīng)力閾值

*P<0.05，與對(duì)照組相比。

2.2 各組大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞VEGF表達(dá)

模型組大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞中VEGF 表達(dá)較空白對(duì)照組低，差異有顯著性意義(P<0.05)；與模型組相比，針刺聯(lián)合組大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞VEGF表達(dá)較強(qiáng)，差異有顯著性意義(P<0.01)，表明針灸聯(lián)合前列地爾治療可以升高VEGF在耳聾模型大鼠耳蝸基地毛細(xì)胞中的表達(dá)水平，見(jiàn)圖1及表2。

表2 各組大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞VEGF表達(dá)灰度值

組別耳數(shù)VEGF對(duì)照組1673.1±11.0模型組1646.5±9.7*前列地爾組16110.4±15.3針刺聯(lián)合前列地爾組16123.9±18.6#

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

2.3 各組大鼠耳蝸組織Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)

與空白組比較，模型組耳蝸組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)減弱，Bax mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺聯(lián)合組Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Bax mRNA表達(dá)減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。表明針灸聯(lián)合前列地爾治療耳聾大鼠可使其Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)抑制Bax mRNA過(guò)度表達(dá)，保護(hù)耳蝸結(jié)構(gòu)。

表3 各組大鼠耳蝸Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

3 討論

耳聾又名 “重聽(tīng)”[3]，是一種聽(tīng)力障礙疾病。噪音性耳聾的主要形成原因是長(zhǎng)時(shí)間的遭受高音貝刺激。發(fā)生噪音性耳聾后，最早出現(xiàn)的癥狀是耳鳴，常為高音調(diào)耳鳴，同時(shí)患者也會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性聽(tīng)力下降，并且伴有頭暈、頭痛等癥狀。噪聲刺激會(huì)導(dǎo)致耳蝸血流循環(huán)障礙，引起細(xì)胞缺氧，最終導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞或其他聽(tīng)神經(jīng)受損。噪音性耳聾一旦形成，很難被治愈，患者的生活質(zhì)量將受到嚴(yán)重的影響。近年來(lái)，噪音性耳聾的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。

研究表明，生物機(jī)體耳蝸內(nèi)的血管收縮、血流速變慢，血流量減少等情況都與長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的噪聲刺激有關(guān)系，進(jìn)而會(huì)出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，血管內(nèi)血液黏度增大，形成血栓，堵塞毛細(xì)血管，形成噪音性耳聾的情況[4-10]。機(jī)體內(nèi)存在一種可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，即VEGF，具有高度的特異性。它在機(jī)體內(nèi)部對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成都有一定的促進(jìn)作用。Bcl-2是機(jī)體內(nèi)部的一種癌基因。CytC自線粒體釋放與它有著密切的關(guān)系，通過(guò)對(duì)線粒體釋放的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡過(guò)程的抑制作用[10-12]。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體凋亡活動(dòng)過(guò)程被抑制的關(guān)鍵因素之一是體內(nèi)Bax蛋白與Bcl-2蛋白之間的比例，由此可見(jiàn) Bax蛋白在控制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，也發(fā)揮著舉足輕重的作用，值得對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究[13]。

近年來(lái)隨著中醫(yī)治療的發(fā)展，針灸也越來(lái)越多的被用于耳鳴耳聾的治療上。針灸包括針刺及艾灸，兩者聯(lián)合應(yīng)用，可以起到打通耳部周圍穴位，增加血液流動(dòng)性，改善耳部周圍血液循環(huán)的作用，對(duì)于耳聾耳鳴的治療有一定的臨床療效。翳風(fēng)是針刺及艾灸常用的穴位之一，為腎氣朝耳之所入，三焦元?dú)庵龅难ㄎ?，與人體的大腦相連，有鎮(zhèn)靜聰耳開(kāi)竅的功效，是治療耳聾常用穴。除此之外，外關(guān)也是針刺艾灸常用穴位，可以溝通手厥陰心包經(jīng)，具有通陽(yáng)維脈的作用[3]。因此取此兩穴作為本次實(shí)驗(yàn)治療噪音性耳聾大鼠的針刺穴位。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞VEGF 表達(dá)較空白對(duì)照組大鼠低，耳蝸Bcl-2 mRNA表達(dá)減弱，Bax mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明噪聲暴露可引起耳蝸組織缺氧，同時(shí)耳蝸組織的缺氧也可引起VEGF 的表達(dá)降低，進(jìn)而影響耳蝸Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)。與模型組相比，針刺聯(lián)合組大鼠VEGF 表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Bax mRNA表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明針刺聯(lián)合前列地爾治療能夠有效的調(diào)節(jié)大鼠耳蝸VEGF、耳蝸Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)。

綜上所述，針刺聯(lián)合前列地爾治療能夠有效的促進(jìn)耳蝸血供的恢復(fù)，此法對(duì)噪音性耳聾的治療效果比單獨(dú)使用前列地爾好。但對(duì)于其他類型的耳聾，其療效有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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