王川林，楊霞，崔秋林，劉全明，袁東，梅小平，彭彬

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系；3.川北醫(yī)學(xué)院電鏡結(jié)構(gòu)研究室，四川 南充 637000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對(duì)各種慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化、增殖從而導(dǎo)致的膠原合成增加是HF發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[1-2]。目前研究認(rèn)為去除病因或給予藥物治療可在組織水平逆轉(zhuǎn)HF的程度，但是迄今尚未發(fā)現(xiàn)能明確阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展的藥物。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)是我國第一個(gè)利用天然藥物甘草中的有效成份提取研制的國家Ⅰ類抗肝炎藥物，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能的作用，臨床上多用于各種肝炎的治療[3-4]。雖然有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MgIG也一定的抗HF的作用[5-6]，但極少應(yīng)用于臨床，也缺乏病理學(xué)證據(jù)支持。為了證實(shí)CCl4大鼠HF的發(fā)生發(fā)展與HSC的關(guān)系，以及MgIG能否通過抑制HSC的活化而改善HF的病理進(jìn)展，本研究擬建立CCl4HF模型，并在建模之初以及建模達(dá)HFⅡ期后分別給予MgIG干預(yù)，采用光鏡和電鏡定性觀察并評(píng)價(jià)MgIG對(duì)CCl4HF大鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)、膠原纖維增生程度以及HSC數(shù)量、形狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MgIG購自江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司，CCl4(分析純)與橄欖油(化學(xué)純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司，無水乙醇購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，多聚甲醛(分析純，使用時(shí)用雙蒸水配制成4%多聚甲醛溶液)購自成都市科龍化工試劑廠，半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(LEICA RM2145,德國)修片機(jī)(LEICA EM TRIM2，德國)，超薄切片機(jī)(LEICA EM UC7，德國)，HT7700透射電子顯微鏡(JEM-1400PLUS，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)3月齡健康SD雄性大鼠32只，體質(zhì)量160～180 g，購自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(10只)、HF模型組(10只)、MgIG早期干預(yù)組(6只)、MgIG晚期干預(yù)組(6只)。

1.3 動(dòng)物模型建立

HF模型制備：將CCl4與橄欖油按體積比2∶3配成40 % CCl4-橄欖油混懸液，按3 mL/kg劑量在大鼠背部皮下注射，每周兩次，建立大鼠HF動(dòng)物模型[7-8]。

MgIG早期干預(yù)模型制備：從CCl4造模開始同時(shí)給予腹腔注射30 mL/kg的MgIG，連續(xù)注射10周后取材。

MgIG晚期干預(yù)模型制備：從CCl4造模開始同時(shí)給予腹腔注射等量生理鹽水，從第6周開始，改為腹腔注射30 mL/Kg的MgIG，連續(xù)注射5周后取材。

對(duì)照組同時(shí)皮下、腹腔注射等量的溶劑，連續(xù)注射10周后取材。

MgIG晚期干預(yù)時(shí)間確定方法：自建立模型第2周起，每周在對(duì)照組與HF模型組各隨機(jī)抽選1只大鼠取肝臟作石蠟包埋切片并行HE染色后按Metavir評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察大鼠肝組織纖維化評(píng)分是否達(dá)Ⅱ期。

1.4 組織處理與切片制備

大鼠稱重，腹腔注射3%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，全自動(dòng)生化儀檢測大鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)。首先剪取一小塊肝組織切成1 mm3大小的組織塊放入2.5%戊二醛固定，制作電鏡超薄切片。其余全部肝組織放入4%的多聚甲醛浸潤固定48 h后制備石蠟包埋切片。

電鏡超薄切片制備： 2.5%戊二醛固定2 h后，0.1M PBS沖洗3次，每只大鼠隨機(jī)抽選5個(gè)組織塊制作電鏡超薄切片：1%四氧化鋨(OsO4)中4 ℃固定2 h后，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂812滲透、包埋。利用超薄切片機(jī)從每個(gè)組織塊切取70 nm厚的連續(xù)超薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電子顯微鏡下觀察。

石蠟切片制備：4%的多聚甲醛浸潤固定48 h后，換入70%乙醇保存，稱重。從每只大鼠肝臟隨機(jī)抽選4個(gè)2 mm厚的組織塊行石蠟包埋，每個(gè)組織塊用半自動(dòng)石蠟切片機(jī)切取2張14 μm厚的石蠟切片，分別采用HE染色(肝組織一般結(jié)構(gòu)觀察)和Masson染色(顯示肝組織內(nèi)的膠原纖維)。

Masson染色步驟：按照Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)說明書進(jìn)行。(1)切片脫蠟處理至水，試劑 A染色5 min，PBS液沖洗，再滴加1滴試劑C(磷鉬酸)5 min，甩干后滴加1滴試劑D(苯胺藍(lán))染色5 min，PBS液沖洗，滴加1滴(100 μL)分化液(試劑 B)分化30 s；(2)甲苯胺藍(lán)復(fù)染細(xì)胞核5～10 s。3.70%酒精、無水酒精脫水，透明，封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MgIG對(duì)大鼠門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)的影響

與對(duì)照組比較，HF模型組、MgIG早期、晚期干預(yù)組的AST、ALP值均顯著升高，HF模型組、MgIG晚期干預(yù)組的ALT值均顯著升高，MgIG早期干預(yù)組的ALT值無顯著變化；與HF模型組比較，MgIG早期和晚期干預(yù)組的AST、ALT、ALP值無顯著變化；與MgIG早期干預(yù)組比較，MgIG晚期干預(yù)組的AST、ALT、ALP值無顯著變化(表1)。

表1 各組大鼠肝功AST、ALT、ALP比較

*P﹤0.05，與對(duì)照組比較。

2.2 MgIG對(duì)CCl4大鼠肝小葉/假小葉直徑及小葉內(nèi)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

HF模型組、MgIG早期和晚期干預(yù)組纖維組織增生破壞正常肝小葉結(jié)構(gòu)形成了假小葉。與對(duì)照組比較，HF模型組、MgIG晚期干預(yù)組的假小葉直徑顯著降低，MgIG早期干預(yù)組假小葉直徑無顯著變化；模型組、MgIG早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組之間假小葉的直徑無顯著性差異(表2，圖1)。

光鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HF模型組肝細(xì)胞體積顯著性增大，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)了脂肪變性、空泡樣變性等病理改變。肝組織內(nèi)可見大小不一的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)，再生的肝細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)嗜酸性；MgIG早期和晚期干預(yù)組肝細(xì)胞光鏡結(jié)構(gòu)改變與HF模型組大鼠間沒有顯著性差異。電鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，HF模型組大鼠肝細(xì)胞直徑顯著增加，部分肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴；部分肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的溶酶體，線粒體腫脹明顯；同時(shí)，在肝細(xì)胞之間的竇周隙內(nèi)出現(xiàn)較多前體細(xì)胞，該細(xì)胞的特征是以橢圓形的細(xì)胞核為主，核周只有極少量的胞質(zhì)；MgIG早期和晚期干預(yù)組大鼠肝臟的超微病理改變與模型組無顯著性差異(圖2)。

表2 MgIG對(duì)大鼠肝組織肝小葉或假小葉直徑的比較

*P﹤0.05，與對(duì)照組比較。

2.3 MgIG對(duì)CCl4大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維分布及體積的影響

正常組大鼠肝組織內(nèi)的膠原纖維主要分布在門管區(qū)，個(gè)別大鼠竇周隙和中央靜脈周圍可見極少量的膠原纖維細(xì)絲。HF模型組大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維顯著增生，竇周隙和中央靜脈周圍可見明顯增厚的膠原纖維束，且隨著病程進(jìn)展，膠原纖維束逐漸增厚，并將正常肝小葉分割成了小而圓的假小葉。電鏡下可見竇周隙增寬，其內(nèi)幾乎充滿膠原纖維，血竇腔明顯變窄甚至塌陷、消失。與HF模型組比較，MgIG早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組大鼠肝組織膠原纖維的分布及纖維化程度均無顯著性改善。

2.4 MgIG對(duì)CCl4大鼠肝組織內(nèi)HSC的影響

在放大2 000倍的電鏡下觀察，對(duì)照組竇周隙1個(gè)視野內(nèi)平均可見1～2個(gè)HSC，呈梭形，胞質(zhì)內(nèi)含數(shù)個(gè)大小不一的脂滴；HF模型組竇周隙1個(gè)視野內(nèi)平均可見5～7個(gè)HSC聚集，且HSC胞體明顯增大，由梭形變?yōu)闄E圓形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量減少或消失；與HF模型組比較，MgIG早期干預(yù)組與MgIG晚期干預(yù)組竇周隙內(nèi)肝星狀細(xì)胞的數(shù)量和形狀均無顯著性差異(圖2)。

3 討論

CCl4皮下注射是建立HF動(dòng)物模型的經(jīng)典方法，其機(jī)制可能與肝細(xì)胞色素P450氧化酶激活后CCl4進(jìn)入體內(nèi)，生成活潑的氯甲基自由基和三氯甲基自由基，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死，反復(fù)刺激形成HF有關(guān)[9]。本研究采用40%CCl4橄欖油溶液3 mL/kg皮下注射(2次/周)誘導(dǎo)SD大鼠HF模型，發(fā)現(xiàn)CCl4注射導(dǎo)致大鼠與肝功能相關(guān)的AST、ALT、ALP值均極顯著升高，光鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示：CCl4注射10周后竇周隙內(nèi)膠原纖維顯著性增加，分割正常肝小葉結(jié)構(gòu)形成了假小葉，其直徑較正常肝小葉顯著性下降，小葉內(nèi)肝細(xì)胞交替出現(xiàn)大量脂肪變性、壞死，繼而肝細(xì)胞再生等病理改變，肝組織內(nèi)未見明顯的炎癥反應(yīng)。該結(jié)果提示，本研究采用CCl4連續(xù)注射10周建立的SD大鼠HF模型是成功的，其形成的肝組織病理學(xué)改變與HF肝硬化的病理改變一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)HSC的數(shù)量明顯增加，體積增大，形態(tài)由梭形變成了橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少等病理改變。已有大量研究表明，HSC的激活、增殖是HF發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-11]。正常狀態(tài)下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到各種病原刺激時(shí)，被激活的HSC一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與HF的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高，這兩類變化最終奠定了HF、門靜脈高壓癥發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)[12]。因此，我們的研究結(jié)果提示CCl4連續(xù)注射可以誘導(dǎo)竇周隙內(nèi)的HSC活化，由此我們推測CCl4所致的HF、肝硬化等病理改變，可能與HSC的活化和增殖有關(guān)。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為肝組織纖維化是不可逆轉(zhuǎn)的，直到上世紀(jì)70年代，Okazaki等[13]首次在HF動(dòng)物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝組織纖維化可逆轉(zhuǎn)的證據(jù)。近年來肝纖維藥物防治的研究取得了初步成效，仍缺乏理想的特異性抗纖維化藥物，中醫(yī)中藥在HF防治方面具有巨大潛力。MgIG是我國第一個(gè)利用天然藥物甘草中的有效成份提取研制的國家Ⅰ類抗肝炎藥物，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同劑量的異甘草酸鎂干預(yù)CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，異甘草酸鎂各劑量組HF大鼠血清中透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、III 型前膠原、IV 型膠原水平顯著下降，而上述指標(biāo)是目前公認(rèn)的HF血清學(xué)指標(biāo)[5]。為了證實(shí)MgIG能否通過抑制HSC的活化而改善HF的發(fā)展，本研究在CCl4建模之初和建模5周(HF評(píng)分達(dá)Ⅱ期)后采用腹腔注射30 mL/kg的MgIG，分別建立了早期和晚期MgIG干預(yù)HF模型，以探討MgIG有無預(yù)防或逆轉(zhuǎn)HF的作用。本實(shí)驗(yàn)通過文獻(xiàn)檢索，使用了多數(shù)研究的認(rèn)為的有效劑量(30 mg/kg)對(duì)HF進(jìn)行干預(yù)[5,14]，我們的結(jié)果顯示MgIG早期干預(yù)，對(duì)CCl4大鼠的肝功能指標(biāo)有一定的改善作用，對(duì)假小葉的形成有一定的緩解作用，但是對(duì)肝細(xì)胞的病理改變、HSC的增生、活化以及膠原纖維的增生無明顯的干預(yù)作用。在HF已經(jīng)形成達(dá)Ⅱ期后再進(jìn)行MgIG干預(yù)，對(duì)CCl4大鼠的肝功能指標(biāo)、光鏡和超微病理結(jié)構(gòu)改變進(jìn)程則均無明顯的改善或逆轉(zhuǎn)作用，對(duì)HSC的活化和增殖也沒有明顯阻斷或抑制的作用。

MgIG的主要作用機(jī)制主要是抗炎和保護(hù)肝細(xì)胞膜，對(duì)肝功能有一定的保護(hù)作用[15]。本研究提示，MgIG早期預(yù)防性用藥，可以保護(hù)CCl4大鼠的肝功能，但是對(duì)肝組織纖維化的進(jìn)程并沒有明顯的抑制作用。本研究只是通過定性觀察判斷MgIG對(duì)HSC數(shù)量和肝組織結(jié)構(gòu)的病理改變，尚需進(jìn)行進(jìn)一步的定量研究進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，本研究只用了一個(gè)劑量進(jìn)行研究，更高或更低劑量的MgIG是否能改善HF化的進(jìn)程尚需進(jìn)一步的研究。

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