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        玫瑰轉(zhuǎn)錄因子RrMYB10的克隆及表達(dá)分析

        2018-07-02 08:56:20李忠健李政宏趙蘭勇徐宗大
        山東林業(yè)科技 2018年2期
        關(guān)鍵詞:花青素玫瑰克隆

        鄒 凱,李忠健,李政宏,趙蘭勇,徐宗大

        (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,山東 泰安 271018)

        花青素(Anthocyanins)是植物組織呈色的重要非光合色素,決定花、果實(shí)、種子的顏色[1-2]。在高等植物中,花青素的合成由苯丙烷途徑中類黃酮合成途徑完成[3],研究表明植物通過合成酶和蛋白來調(diào)控花青苷的合成,而MYB、WD40和bHLH三類轉(zhuǎn)錄因子是這些酶和蛋白合成過程中的主要轉(zhuǎn)錄因子,三者組成三元復(fù)合體來調(diào)控花青苷的合成和積累[4-5]。其中,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物花青苷合成的中起著重要的作用,前人研究結(jié)果表明,在月季[6]、金魚草[7]、擬南芥[8]以及葡萄[9]中,R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子對花青苷的合成起著至關(guān)重要的作用。

        玫瑰(Rusa rugosa)為薔薇科薔薇屬的一種落葉灌木,觀賞價值高,芳香四溢,在園林造景中具有重要作用[10]。玫瑰花色單一是制約玫瑰應(yīng)用的主要問題,玫瑰花色主要為玫紅色、粉色、白色,鮮見其他花色。所以,克隆玫瑰花瓣中有關(guān)調(diào)控花青苷的基因,對闡明玫瑰花瓣中花色苷的調(diào)控機(jī)理,進(jìn)而改變玫瑰的花色具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)時間和地點(diǎn)

        試驗(yàn)于2016年4月至2017年1月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南?;ɑ軐?shí)驗(yàn)基地及花卉研究室進(jìn)行。

        1.2 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)材料為玫瑰品種 ‘紫枝’(Rosa rugosa‘Zizhi’)、‘白紫枝’(Rosa rugosa‘Baizizhi’)以及‘粉紫枝’(Rosa rugosa‘Fenzizhi’),于 2016 年 4 月-5月份選取生長勢強(qiáng),花色穩(wěn)定單株,采集花瓣經(jīng)液氮處理后,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 基因克隆

        玫瑰花瓣參照改良CTAB法[11]以及EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的說明書提取其總RNA于用-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?,運(yùn)用紫外分光光度法檢測所提取RNA的純度和濃度。將濃度及參數(shù)符合要求的RNA參照abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)玫瑰花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),查找得到目的基因的RrMYB10的部分cDNA序列,根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)特異性引物[20]:

        RrMYB10 F:5’ -ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

        RrMYB10 R:5’ -CAACCCAGAAGTTTGTAAAGAAGTCG-3’

        以上一步合成的cDNA為模板,用設(shè)計(jì)的特異性引物PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系為:滅菌ddH2O 9.5ul、2×EasyTaqSuperMix 12.5?l、 目的基因上下游引物各 1?l、模板cDNA 1ul,總計(jì)25ul。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 5min;94℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 1min,35 個循環(huán),72℃保溫 10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外燈下參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶,將目的條帶連接到PMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送華大測序。

        3’RACE擴(kuò)增,根據(jù)測序得到目的基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)巢式PCR基因特異性引物[20],進(jìn)行巣式PCR擴(kuò)增:

        RrMYB10-1:5’-ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

        RrMYB10-2:5’-ACTTCTTTACAAACTTCTGGG-3’;

        B26:5’ -GACTCTAGACGACATCGATTTTTTT TTTTTTTTTT-3’。

        將濃度及參數(shù)符合要求的RNA參照abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以上一步合成的cDNA為模板,用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行巣式PCR擴(kuò)增。第一輪PCR:引物RrMYB10-1與B26做第一輪PCR的引物,PCR反應(yīng)體系同上,反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min;94℃變性 30s,58℃退火30s,72℃延伸 1min,35 個循環(huán),72℃保溫 10min。第二輪PCR:引物RrMYB10-2與B26作為第二輪PCR引物,第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100、500、700倍作模板,反應(yīng)體系同上,反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min;94℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 1min,35 個循環(huán),72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶,將目的條帶連接PMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送華大測序。

        1.3.2 生物信息學(xué)分析

        利用NCBI中的Blast比對軟件對目的基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,利用DNAMAN軟件對目的基因和其他物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析;利用ExPasy服務(wù)器中在線軟件ProtParam對目的基因進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測;通過NCBI中在線軟件CD-Search對目的基因的保守域進(jìn)行預(yù)測;利用在線軟件SOPMA對目的基因編碼的蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用在線軟件NetPhos 3.1Serve和NetOGLyc 4.0 Server對目的基因編碼的蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和信號肽進(jìn)行預(yù)測;利用在線軟件TMpred對目的基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測;利用MEGA5.0構(gòu)建RrMYB10的系統(tǒng)樹。

        1.3.3 構(gòu)建表達(dá)載體

        根據(jù)RrMYB10的測序結(jié)果,除去終止子,設(shè)計(jì)分別含有NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)的引物[20]。

        RrMYB10 NF:5’-CCCATGGCCATGGAGGGTTT CGGCGTGAGA-3’

        RrMYB10 BR:5’-CACGTGGTCAACGACTAGA TCATGGC-3’

        以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的目的條帶,其擴(kuò)增產(chǎn)物通過NcoI和BstEII雙酶切后,利用SolutionI將同樣雙酶切的pc1304載體與雙酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物在16℃條件下連接4h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,篩選陽性克隆,送華大進(jìn)行測序驗(yàn)證得到構(gòu)建好的表達(dá)載體pc1304-RrMYB10。

        2 結(jié)果與分析

        2.1RrMYB10的克隆

        以玫瑰花瓣cDNA為模板,擴(kuò)增得到643bp的cDNA序列,通過3’RACE擴(kuò)增后得到251bp的一段cDNA序列,兩者經(jīng)過拼接后得到871bp的cDNA序列全長 (圖2),利用DNAMAN對RrMYB10的堿基序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其包括完整的開放閱讀框 (ORF),含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG,開放閱讀框長度699bp,編碼232個氨基酸,含有polyA尾巴(圖1)。經(jīng)過NCBI中blastx比對顯示,該基因與其他物種中MYB10的基因序同源性蛋白。構(gòu)成RrMYB10蛋白的232個氨基酸中,一共包括20中氨基酸,其中亮氨酸(Leu)所占比例最大為 9.4%;其次是賴氨酸(Lys)和甘氨酸(Gly),所占高,故將基因命名為RrMYB10。

        圖1 RrMYB10基因的cDNA序列及氨基酸序列Fig.1 RrMYB10 cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

        圖2RrMYB10基因的擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of RrMYB10

        2.2 RrMYB10生物信息學(xué)分析

        2.2.1 蛋白基本理化性質(zhì)分析

        RrMYB10編碼232個氨基酸,利用在線軟件ProtParam分析表明,RrMYB10蛋白的分子式為C1230H1904N348O356S6,相對分子質(zhì)量為27455.13Da,原子總數(shù)為3844個,等電點(diǎn)pI=9.01,該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.31(>40),所提推測出該蛋白為堿性不穩(wěn)定比例都是8.2%;所占比例最小的氨基酸是半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met),所占比例均為 1.3%。利用在線軟件ProtScale預(yù)測RrMYB10蛋白的疏水性,疏水性最大值為1.400,最小值為-3.189,平均疏水指數(shù)為-0.762,說明該蛋白偏親水蛋白。利用NCBI中在線軟件CD-Search對RrMYB10蛋白進(jìn)行分析表明該蛋白含有Myb的保守域,序列在5’端22-165位具有pfam00249結(jié)構(gòu)域,屬于MYB的保守結(jié)構(gòu)域(圖 3)。

        圖3 RrMYB10基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prcdicts conservative structure domain of RrMYB10

        經(jīng)在線軟件SOPMA分析,發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋(Alpha helix)和無規(guī)則卷曲(Random coil)為主,其數(shù)量和所占比例分別為95個(40.77%)和 76個(32.62%);其次是延伸鏈(Extended strand)和 β-轉(zhuǎn)角(Beta turn),其數(shù)量和所占比例分別為 41個(17.60%)和 21個(9.01%)(圖 4)。

        經(jīng)在線軟件NetPhos 3.1 Server分析,發(fā)現(xiàn)4.0Server分析,發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白無糖基化位點(diǎn),N端沒有發(fā)現(xiàn)信號肽。經(jīng)在線軟件TMHMM分析RrMYB10蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)與,發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

        2.2.2 蛋白序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

        圖4 RrMYB10基因蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predication of secondary structure of RrMYB10

        圖5RrMYB10與其它物種MYB蛋白序列對Fig.5 Multiple alignment of theRrMYB10 with other MYB

        根據(jù)NCBI中blast比對結(jié)果,選擇同源性較高的野草莓(Fragaria vesca)78% 、梅(Prunus mume)62%、甜櫻桃(Prunus avium)62%以及桃樹(Prunus RrMYB10基因編碼的蛋白中,含有15個Ser磷酸化位點(diǎn),15個Thr磷酸化位點(diǎn),8個Tyr磷酸化位點(diǎn),這些磷酸位點(diǎn)的存在說明該蛋白在可逆磷酸化調(diào)控中具有一定的作用。經(jīng)在線軟件NetOGLyc persica)62%進(jìn)行多重序列比對,比對結(jié)果如圖,結(jié)果表明RrMYB10蛋白具有MYB保守結(jié)構(gòu)域(圖5)。

        圖6 RrMYB10與其它物種MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid secquences of RrMYB10 and other MYB

        為了進(jìn)一步探究RrMYB10蛋白與其他植物中MYB蛋白的親緣關(guān)系,從Blast比對的結(jié)果中選取了野草莓、梅、甜櫻桃在內(nèi)的13個物種的氨基酸序列,利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。結(jié)果表明玫瑰先與同科的草莓、野草莓最先聚合,說明在進(jìn)化上玫瑰與草莓親緣關(guān)系最近,接著與同科的蘋果、沙梨聚合為一個亞類,再與其他科物種聚合,說明,同科的植物之間親緣關(guān)系近,與不同科的其他植物親緣關(guān)系遠(yuǎn)(圖6)。

        2.3 RrMYB10載體構(gòu)建

        為了明確RrMYB10蛋白的功能,將構(gòu)建好的載體pc1304-RrMYB10利用液氮速凍法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌配制成侵染液侵染擬南芥,計(jì)劃后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。

        3 結(jié)論與討論

        MYB家族是植物生命體中最為重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,參與調(diào)控植物生長發(fā)育、生理代謝的各個方面[13]。R2R3-MYB主要參與植物次生代謝、細(xì)胞分化以及各種脅迫的調(diào)控[14]。本研究通過RTPCR以及RACE技術(shù)從玫瑰花瓣中分離得到了一個R2R3-MYB基因,該基因包含完整的開放閱讀框699bp,編碼232個氨基酸,其蛋白分子式為C1230H1904N348O356S6,相對分子質(zhì)量為27455.13Da,等電點(diǎn) pI為 9.01,該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為 42.31(>40),為不穩(wěn)定蛋白。

        花青素屬于類黃酮類物質(zhì),也是植物組織著色的重要代謝產(chǎn)物[15]。Vimolmangkang等[16]發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)蘋果R2R3型Md MYB3促進(jìn)煙草的花青素苷和黃酮醇的合成,使轉(zhuǎn)基因煙草的花色變深。趙佳[6]等發(fā)現(xiàn)R2R3型 RhMYBs4-1和 RhMYBs6-1蛋白均可能促進(jìn)花青苷的合成,本文研究所得到RrMYB10蛋白聚類分析發(fā)現(xiàn)與已報(bào)到的野草莓(ABX79948.1)、梅花(XP_008244325.1)以及甜櫻桃(AJB28496.1)等聚為一類,而這些MYB均有典型的R2R3結(jié)構(gòu),說明RrMYB10也具有典型的R2R3結(jié)構(gòu)。

        近幾年的研究過程中,植物中花青素的合成與其相關(guān)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的研究有了一定進(jìn)展。Khar[17]等發(fā)現(xiàn)不同植物體內(nèi)花青素的合成受到不同調(diào)控位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄因子的控制;謝吉容等[18]發(fā)現(xiàn)R3型的MYB蛋白基因RhMYB1在粉紅色花瓣中的表達(dá)比黃色花瓣高,李軍[19]等發(fā)現(xiàn)在桑樹花青素的合成調(diào)控過程中,不同的MYB蛋白是有正負(fù)調(diào)控之分的。故本研究所克隆的RrMYB10只能確定其與花青素的調(diào)控有關(guān),其具體作用還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。

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