鄒 凱，李忠健，李政宏，趙蘭勇，徐宗大

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018）

花青素（Anthocyanins）是植物組織呈色的重要非光合色素，決定花、果實、種子的顏色[1-2]。在高等植物中，花青素的合成由苯丙烷途徑中類黃酮合成途徑完成[3]，研究表明植物通過合成酶和蛋白來調(diào)控花青苷的合成，而MYB、WD40和bHLH三類轉(zhuǎn)錄因子是這些酶和蛋白合成過程中的主要轉(zhuǎn)錄因子，三者組成三元復(fù)合體來調(diào)控花青苷的合成和積累[4-5]。其中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物花青苷合成的中起著重要的作用，前人研究結(jié)果表明，在月季[6]、金魚草[7]、擬南芥[8]以及葡萄[9]中，R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子對花青苷的合成起著至關(guān)重要的作用。

玫瑰（Rusa rugosa）為薔薇科薔薇屬的一種落葉灌木，觀賞價值高，芳香四溢，在園林造景中具有重要作用[10]。玫瑰花色單一是制約玫瑰應(yīng)用的主要問題，玫瑰花色主要為玫紅色、粉色、白色，鮮見其他花色。所以，克隆玫瑰花瓣中有關(guān)調(diào)控花青苷的基因，對闡明玫瑰花瓣中花色苷的調(diào)控機理，進(jìn)而改變玫瑰的花色具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2016年4月至2017年1月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南?；ɑ軐嶒灮丶盎ɑ苎芯渴疫M(jìn)行。

1.2 試驗材料

試驗材料為玫瑰品種 ‘紫枝’（Rosa rugosa‘Zizhi’）、‘白紫枝’（Rosa rugosa‘Baizizhi’）以及‘粉紫枝’（Rosa rugosa‘Fenzizhi’），于 2016 年 4 月-5月份選取生長勢強，花色穩(wěn)定單株，采集花瓣經(jīng)液氮處理后，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 基因克隆

玫瑰花瓣參照改良CTAB法[11]以及EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的說明書提取其總RNA于用-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，運用紫外分光光度法檢測所提取RNA的純度和濃度。將濃度及參數(shù)符合要求的RNA參照abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)玫瑰花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，查找得到目的基因的RrMYB10的部分cDNA序列，根據(jù)所得序列設(shè)計特異性引物[20]：

RrMYB10 F：5’ -ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

RrMYB10 R：5’ -CAACCCAGAAGTTTGTAAAGAAGTCG-3’

以上一步合成的cDNA為模板，用設(shè)計的特異性引物PCR擴增目的基因。PCR反應(yīng)體系為：滅菌ddH2O 9.5ul、2×EasyTaqSuperMix 12.5?l、 目的基因上下游引物各 1?l、模板cDNA 1ul，總計25ul。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)，72℃保溫 10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶，將目的條帶連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送華大測序。

3’RACE擴增，根據(jù)測序得到目的基因的cDNA序列，設(shè)計巢式PCR基因特異性引物[20]，進(jìn)行巣式PCR擴增：

RrMYB10-1：5’-ATGGAGGGTTTCGGCGTGAGA-3’

RrMYB10-2：5’-ACTTCTTTACAAACTTCTGGG-3’；

B26：5’ -GACTCTAGACGACATCGATTTTTTT TTTTTTTTTT-3’。

將濃度及參數(shù)符合要求的RNA參照abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以上一步合成的cDNA為模板，用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行巣式PCR擴增。第一輪PCR：引物RrMYB10-1與B26做第一輪PCR的引物，PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s，58℃退火30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)，72℃保溫 10min。第二輪PCR：引物RrMYB10-2與B26作為第二輪PCR引物，第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100、500、700倍作模板，反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)，72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照Magen膠回收試劑盒說明書回收目的條帶，將目的條帶連接PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送華大測序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的Blast比對軟件對目的基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，利用DNAMAN軟件對目的基因和其他物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析；利用ExPasy服務(wù)器中在線軟件ProtParam對目的基因進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測；通過NCBI中在線軟件CD-Search對目的基因的保守域進(jìn)行預(yù)測；利用在線軟件SOPMA對目的基因編碼的蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用在線軟件NetPhos 3.1Serve和NetOGLyc 4.0 Server對目的基因編碼的蛋白進(jìn)行磷酸化位點、糖基化位點和信號肽進(jìn)行預(yù)測；利用在線軟件TMpred對目的基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；利用MEGA5.0構(gòu)建RrMYB10的系統(tǒng)樹。

1.3.3 構(gòu)建表達(dá)載體

根據(jù)RrMYB10的測序結(jié)果，除去終止子，設(shè)計分別含有NcoI和BstEII酶切位點的引物[20]。

RrMYB10 NF：5’-CCCATGGCCATGGAGGGTTT CGGCGTGAGA-3’

RrMYB10 BR：5’-CACGTGGTCAACGACTAGA TCATGGC-3’

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴增得到帶有酶切位點的目的條帶，其擴增產(chǎn)物通過NcoI和BstEII雙酶切后，利用SolutionI將同樣雙酶切的pc1304載體與雙酶切后的擴增產(chǎn)物在16℃條件下連接4h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽性克隆，送華大進(jìn)行測序驗證得到構(gòu)建好的表達(dá)載體pc1304-RrMYB10。

2 結(jié)果與分析

2.1RrMYB10的克隆

以玫瑰花瓣cDNA為模板，擴增得到643bp的cDNA序列，通過3’RACE擴增后得到251bp的一段cDNA序列，兩者經(jīng)過拼接后得到871bp的cDNA序列全長 （圖2），利用DNAMAN對RrMYB10的堿基序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其包括完整的開放閱讀框 （ORF），含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，開放閱讀框長度699bp，編碼232個氨基酸，含有polyA尾巴（圖1）。經(jīng)過NCBI中blastx比對顯示，該基因與其他物種中MYB10的基因序同源性蛋白。構(gòu)成RrMYB10蛋白的232個氨基酸中，一共包括20中氨基酸，其中亮氨酸（Leu）所占比例最大為 9.4%；其次是賴氨酸（Lys）和甘氨酸（Gly），所占高，故將基因命名為RrMYB10。

圖1 RrMYB10基因的cDNA序列及氨基酸序列Fig.1 RrMYB10 cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

圖2RrMYB10基因的擴增Fig.2 PCR amplification of RrMYB10

2.2 RrMYB10生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白基本理化性質(zhì)分析

RrMYB10編碼232個氨基酸，利用在線軟件ProtParam分析表明，RrMYB10蛋白的分子式為C1230H1904N348O356S6，相對分子質(zhì)量為27455.13Da，原子總數(shù)為3844個，等電點pI=9.01，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.31（＞40）,所提推測出該蛋白為堿性不穩(wěn)定比例都是8.2%；所占比例最小的氨基酸是半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met），所占比例均為 1.3%。利用在線軟件ProtScale預(yù)測RrMYB10蛋白的疏水性，疏水性最大值為1.400，最小值為-3.189，平均疏水指數(shù)為-0.762，說明該蛋白偏親水蛋白。利用NCBI中在線軟件CD-Search對RrMYB10蛋白進(jìn)行分析表明該蛋白含有Myb的保守域，序列在5’端22-165位具有pfam00249結(jié)構(gòu)域，屬于MYB的保守結(jié)構(gòu)域（圖 3）。

圖3 RrMYB10基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prcdicts conservative structure domain of RrMYB10

經(jīng)在線軟件SOPMA分析，發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋（Alpha helix）和無規(guī)則卷曲（Random coil）為主，其數(shù)量和所占比例分別為95個（40.77%）和 76個（32.62%）；其次是延伸鏈（Extended strand）和 β-轉(zhuǎn)角（Beta turn），其數(shù)量和所占比例分別為 41個（17.60%）和 21個（9.01%）（圖 4）。

經(jīng)在線軟件NetPhos 3.1 Server分析，發(fā)現(xiàn)4.0Server分析，發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白無糖基化位點，N端沒有發(fā)現(xiàn)信號肽。經(jīng)在線軟件TMHMM分析RrMYB10蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)與，發(fā)現(xiàn)RrMYB10蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2.2 蛋白序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 RrMYB10基因蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predication of secondary structure of RrMYB10

圖5RrMYB10與其它物種MYB蛋白序列對Fig.5 Multiple alignment of theRrMYB10 with other MYB

根據(jù)NCBI中blast比對結(jié)果，選擇同源性較高的野草莓（Fragaria vesca）78% 、梅（Prunus mume）62%、甜櫻桃（Prunus avium）62%以及桃樹（Prunus RrMYB10基因編碼的蛋白中，含有15個Ser磷酸化位點，15個Thr磷酸化位點，8個Tyr磷酸化位點，這些磷酸位點的存在說明該蛋白在可逆磷酸化調(diào)控中具有一定的作用。經(jīng)在線軟件NetOGLyc persica）62%進(jìn)行多重序列比對，比對結(jié)果如圖，結(jié)果表明RrMYB10蛋白具有MYB保守結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖6 RrMYB10與其它物種MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid secquences of RrMYB10 and other MYB

為了進(jìn)一步探究RrMYB10蛋白與其他植物中MYB蛋白的親緣關(guān)系，從Blast比對的結(jié)果中選取了野草莓、梅、甜櫻桃在內(nèi)的13個物種的氨基酸序列，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。結(jié)果表明玫瑰先與同科的草莓、野草莓最先聚合，說明在進(jìn)化上玫瑰與草莓親緣關(guān)系最近，接著與同科的蘋果、沙梨聚合為一個亞類，再與其他科物種聚合，說明，同科的植物之間親緣關(guān)系近，與不同科的其他植物親緣關(guān)系遠(yuǎn)（圖6）。

2.3 RrMYB10載體構(gòu)建

為了明確RrMYB10蛋白的功能，將構(gòu)建好的載體pc1304-RrMYB10利用液氮速凍法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌配制成侵染液侵染擬南芥，計劃后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗證。

3 結(jié)論與討論

MYB家族是植物生命體中最為重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、生理代謝的各個方面[13]。R2R3-MYB主要參與植物次生代謝、細(xì)胞分化以及各種脅迫的調(diào)控[14]。本研究通過RTPCR以及RACE技術(shù)從玫瑰花瓣中分離得到了一個R2R3-MYB基因，該基因包含完整的開放閱讀框699bp，編碼232個氨基酸，其蛋白分子式為C1230H1904N348O356S6，相對分子質(zhì)量為27455.13Da，等電點 pI為 9.01，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為 42.31（＞40）,為不穩(wěn)定蛋白。

花青素屬于類黃酮類物質(zhì)，也是植物組織著色的重要代謝產(chǎn)物[15]。Vimolmangkang等[16]發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)蘋果R2R3型Md MYB3促進(jìn)煙草的花青素苷和黃酮醇的合成，使轉(zhuǎn)基因煙草的花色變深。趙佳[6]等發(fā)現(xiàn)R2R3型 RhMYBs4-1和 RhMYBs6-1蛋白均可能促進(jìn)花青苷的合成，本文研究所得到RrMYB10蛋白聚類分析發(fā)現(xiàn)與已報到的野草莓（ABX79948.1）、梅花（XP_008244325.1）以及甜櫻桃（AJB28496.1）等聚為一類，而這些MYB均有典型的R2R3結(jié)構(gòu)，說明RrMYB10也具有典型的R2R3結(jié)構(gòu)。

近幾年的研究過程中，植物中花青素的合成與其相關(guān)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的研究有了一定進(jìn)展。Khar[17]等發(fā)現(xiàn)不同植物體內(nèi)花青素的合成受到不同調(diào)控位點以及轉(zhuǎn)錄因子的控制；謝吉容等[18]發(fā)現(xiàn)R3型的MYB蛋白基因RhMYB1在粉紅色花瓣中的表達(dá)比黃色花瓣高，李軍[19]等發(fā)現(xiàn)在桑樹花青素的合成調(diào)控過程中，不同的MYB蛋白是有正負(fù)調(diào)控之分的。故本研究所克隆的RrMYB10只能確定其與花青素的調(diào)控有關(guān)，其具體作用還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗證。

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