呂殷婷 焦舉 楊婷 鄒瓊 江淑琴 張勇

前列腺癌是全球第二常見的男性惡性腫瘤[1]。雖然前列腺癌可以早期診斷及治療，但仍然是全世界男性癌癥死亡的第六大原因[2]。目前，針對前列腺癌治療的方式主要有手術切除、放射治療、內分泌治療等幾大類[3]。然而，大多數(shù)前列腺癌在去勢手術治療后2年內最終將轉化為去勢抵抗型前列腺癌，亦稱為難治性前列腺癌(CRPC)。近年來，許多研究者提出了“前列腺腫瘤干細胞(PCSC)”的概念，認為這可能是前列腺癌的細胞起源，并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、復發(fā)、去勢抵抗及耐藥等多個方面發(fā)揮作用[4]。腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產生腫瘤異質性的細胞，其特性還包括具有分化潛能、高致瘤性等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，從前列腺移植瘤中獲取的CD44+細胞具有干細胞特性。CD44是一種細胞表面分子，在細胞黏附、信號轉導、腫瘤遷移進展等多方面有重要作用，也被公認為是細胞具有干性傾向的分子標志。本研究選取人前列腺癌DU-145細胞進行無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，從而富集、分離腫瘤干細胞并鑒定其特性，以期利用一種簡單、快捷、有效的方法實現(xiàn)前列腺腫瘤干細胞的制備，為后續(xù)更多針對前列腺癌干細胞靶向治療的研究奠定基礎。

材料與方法

一、材 料

人前列腺癌LNCaP、DU-145細胞株購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司。青霉素鏈霉素混合液、0.05%胰酶(含EDTA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素、B27購自美國Sigma公司。人重組表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)購于美國PeproTech公司。胰酶抑制劑購自索萊寶公司。超低黏附6孔培養(yǎng)板購自美國Corning公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD44抗體及其同型抗體(IgG2b)、流式細胞儀購自美國BD公司。CCK8增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。550型酶標儀購自美國Bio-rad公司。4～6周齡的NOD-SCID雄性裸鼠，體質量18～20 g，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中山大學北校區(qū)動物實驗中心SPF級動物房，實驗遵循動物倫理要求。

二、方 法

1.細胞培養(yǎng)及傳代

將RPMI-1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液制備成含血清培養(yǎng)基(SSM)。將體積分數(shù)2% B27、0.4%BSA、5 μg/ml胰島素、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF加入DMEM/F12培養(yǎng)基制備成無血清培養(yǎng)基(SFM)。DU-145細胞在SSM中培養(yǎng)時，每2 d進行細胞換液或傳代；在SFM中培養(yǎng)時，每日觀察懸浮細胞生長情況并輕搖晃培養(yǎng)瓶避免細胞貼壁，每3 d進行細胞換液，每7 d進行細胞傳代。細胞傳代時，棄舊培養(yǎng)基，加入1 ml胰酶共孵育2 min后，加入2 ml胰酶抑制劑(或SSM)終止消化，后繼續(xù)按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況。

2.LNCaP、DU-145細胞中CD44+表達情況的檢測

取經SSM培養(yǎng)至對數(shù)生長期的LNCaP細胞和DU-145細胞，分別以1×106個重懸于100 μl PBS溶液中，2種細胞各制備3管，分別為空白管、同型對照管(含1 μl IgG2b)、FITC-CD44抗體管(含1 μl FITC-Anti CD44)避光4 ℃反應15 min后，加入1 ml PBS，1 000轉/分離心3 min，輕倒掉上清液后加入400 μl PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測CD44+細胞比例。

3.DU-145細胞無血清傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細胞及成球率的計算

取經SSM培養(yǎng)至對數(shù)生長期的DU-145細胞，經40 μm孔徑細胞篩濾過，用PBS離心清洗1次以去除血清后，以3×104個/孔重新鋪板于超低黏附6孔板中，加入SFM繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。每日搖晃1次培養(yǎng)板避免細胞貼壁，每3 d換1次液，分別于第20 h、2 d、7 d、14 d在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察。以形態(tài)立體、腫瘤細胞微球直徑>60 μm定義為成球，連續(xù)計數(shù)5個視野取平均值計算成球率。成球率=該視野內成球細胞個數(shù)/該視野內總細胞個數(shù)×100%。

4.SSM和SFM中檢測DU-145腫瘤微球細胞的分化能力

將連續(xù)在SFM中培養(yǎng)14 d后的DU-145腫瘤微球細胞用胰酶消化分離后，用SSM終止反應，1 000 轉/分離心3 min后棄上清液，加入新鮮SSM重懸細胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，動態(tài)觀察并記錄細胞形態(tài)變化情況。收集細胞，再次用500 μl胰酶消化3 min后用1 ml胰酶抑制劑終止反應，離心后，用新鮮SFM重懸細胞并動態(tài)觀察記錄細胞形態(tài)變化情況。

5.DU-145腫瘤微球細胞的體外增殖能力檢測

分別將DU-145細胞、DU-145腫瘤微球細胞制備成單細胞懸液，以103個/100 μl的密度在96孔板中各接種3孔，使用SSM、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每塊板設置3個含100 μl SSM但不含細胞的的空白孔，以后每隔2 d換液1次。第1～8日，每日于同一時間給一塊板加入10 μl CCK-8工作液后與細胞避光繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1.5 h后，利用酶標儀測定450 nm處吸光度(OD450)，并繪制細胞增殖曲線。

6.檢測DU-145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內的成瘤情況

DU-145細胞(6.5×105/100 μl)、DU-145腫瘤微球細胞(6.5×104/100 μl)分別消化、離心后以PBS重懸為上述密度單細胞懸液。將6只雄性NOD-SCID裸鼠稱重后隨機分為2組，每組3只。每只裸鼠注射100 μl細胞懸液和100 μl基質膠混合液于左后腿根部皮下，動態(tài)觀察2組裸鼠的成瘤情況，待肉眼可見腫瘤后，每5 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=(π×長徑×短徑2/6)mm3，35 d后處死裸鼠，并繪制腫瘤生長曲線。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、LNCaP細胞、DU-145細胞中CD44+細胞比例比較

CD44+LNCaP細胞、CD44+DU-145細胞比例分別為0.4%、97.6%，見圖1。CD44+DU-145細胞比例約為CD44+LNCaP細胞的271倍。

二、DU-145細胞無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細胞及成球率

DU-145細胞具有干細特征的部分可以在無血清培養(yǎng)基中生存并逐漸形成懸浮細胞球：懸浮培養(yǎng)20 h時，單個細胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；懸浮培養(yǎng)第2日可觀察到一小部分細胞表現(xiàn)出成球團的趨勢，成球率為(14.4±7.8)%；第7日可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成，成球率為(34.2±8.7)%；懸浮培養(yǎng)第14日，成球率明顯較第7日增加，滿視野內可觀察到立體形態(tài)的懸浮球，成球率為(61.4±7.6)%。并且DU-145腫瘤微球細胞在經過無血清懸浮培養(yǎng)傳代后，仍可形成與原細胞形態(tài)類似的次代并逐漸形成懸浮腫瘤微球細胞，見圖2。

三、DU-145腫瘤微球細胞的分化能力

將無血清懸浮培養(yǎng)的DU-145腫瘤微球細胞轉入含10%胎牛血清中培養(yǎng)10 h，已能觀察到細胞貼壁，24 h后其伸出偽足逐漸形成單層貼壁細胞，形態(tài)與常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU-145相近，見圖3。再次將其轉入無血清懸浮培養(yǎng)，仍能在20 h后觀察到單個細胞開始出芽，形成一些懸浮細胞團，繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，可觀察到典型腫瘤細胞球形成。

四、DU-145腫瘤微球細胞的體外增殖能力

DU-145腫瘤微球細胞與普通DU-145細胞在鋪板后第2日的OD450分別為0.757±0.059、0.373±0.068，DU-145腫瘤微球細胞增殖能力達到普通DU-145細胞2倍左右(t=7.382，P<0.05)。從第6日開始，兩者皆進入生長平臺期。到第8日，DU-145腫瘤微球細胞與普通DU-145細胞的OD450分別為0.228±0.063、0.086±0.036，DU-145腫瘤微球細胞存活量仍高于DU-145細胞(t=3.373,P<0.05)，見圖4。

五、DU-145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內的成瘤情況

DU-145細胞組種植細胞的數(shù)量級是DU-145腫瘤微球細胞組的10倍，但在移植瘤細胞接種裸鼠后第10日，DU-145細胞組僅2只裸鼠可見皮下成瘤，瘤體體積(8.4±1.2)mm3，成瘤率2/3，而DU-145腫瘤微球細胞組3只裸鼠均可見皮下腫瘤形成，瘤體體積(28.1±5.9)mm3，成瘤率為3/3，DU-145腫瘤微球細胞組在第10日的瘤體體積大于DU-145細胞組(t=4.464，P<0.05)。接種后第30～35日為移植瘤快速生長期，DU-145細胞組生長速度為(69.2±20.1)mm3/d，DU-145腫瘤微球細胞組為(376.3±45.1)mm3/d，DU-145腫瘤微球細胞組生長速度達到DU-145細胞組的5倍(t=8.709，P<0.05)，見圖5A。DU-145細胞與DU-145腫瘤微球細胞移植瘤在裸鼠體內生長35 d后活體情況見圖5B、C。

圖1 LNCaP細胞、DU-145細胞中CD44+細胞流式細胞儀檢測結果

A、B：LNCaP細胞；C、D：DU-145細胞

圖2 不同時間點懸浮培養(yǎng)DU-145細胞腫瘤微球細胞形成情況(×100)

A：懸浮培養(yǎng)20 h時，單個細胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；B：懸浮培養(yǎng)第2日，可觀察到一小部分細胞表現(xiàn)出成球團的趨勢；C：懸浮培養(yǎng)第7日，可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成；D：懸浮培養(yǎng)第14日，滿視野內可觀察到立體形態(tài)的懸浮球；標尺=60 μm

圖3 DU-145腫瘤微球細胞、DU-145細胞在SMM中培養(yǎng)2 d的形態(tài)對比(×100)

A：DU-145腫瘤微球細胞；B: DU-145細胞

圖4 DU-145細胞與DU-145腫瘤微球細胞的體外增殖能力比較

圖5 DU-145細胞與DU-145腫瘤微球細胞的體內致瘤能力比較

A：接種DU-145細胞與DU-145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內的移植瘤體積增長曲線；B：DU-145細胞在免疫缺陷裸鼠體內35 d生長情況，紅色箭頭為裸鼠皮下成瘤處；C：DU-145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內35 d生長情況

討 論

近年來，研究者們已在多種腫瘤中分離并證實存在腫瘤干細胞[6-7]。在既往關于前列腺癌治療的相關報道中，基本是以前列腺癌細胞系為研究對象進行體內外研究。然而越來越多的研究表明，前列腺腫瘤干細胞才是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源。為此，本研究通過簡單易行的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法富集、分離前列腺腫瘤干細胞，并證明了其腫瘤干細胞相關特性，以期為針對前列腺腫瘤干細胞的診斷及治療研究奠定基礎。雖然，免疫磁珠分選法和流式分選法也是為研究者們所熟知的分選、富集腫瘤干細胞的另外2種常見方法。但是，這2種方法相較于本研究所使用的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法，對科研設備要求更高，費用也較為昂貴，例如利用免疫磁珠法分選CD44+DU-145細胞需要合適的磁場，以及同時制備大量的DU-145細胞(108數(shù)量級)進行分選，對研究實驗要求較高[8]。若利用流式分選法進行CD44+DU-145細胞分選，由于流式細胞儀分選通道較長易造成細胞污染，且分選步驟復雜容易損傷細胞活性，分選得到的細胞難以用于后續(xù)實驗[9]。

雖然既往研究顯示，CD44分子仍表達于結腸癌、頭頸部鱗癌、胃癌、膀胱癌、神經膠質瘤、鼻咽癌等腫瘤細胞[10-11]。但本研究選用的是CD44+人前列腺癌DU-145細胞系，研究對象為前列腺癌，并通過無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式富集得到了具有干性特征的前列腺腫瘤細胞。因此，這與CD44不僅表達在前列腺腫瘤干細胞的特性并不沖突。

研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細胞株如 LNCaP、DU145及PC-3 中，CD44+細胞比 CD44-細胞有更強的增殖及成瘤的能力。 Ugolkov 等[12]指出，在前列腺癌組織中CD44+細胞約占72%，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往干細胞僅占據(jù)組織細胞很小比例的認識。本研究中，流式細胞儀檢測結果示DU-145細胞系中CD44+細胞約占97.6%，與Ugolkov等的觀點相符。

綜上所述，本研究通過對DU-145細胞系連續(xù)傳代無血清培養(yǎng)富集、分離得到了具有干性特征的腫瘤細胞。這對于腫瘤干細胞這一類較難獲取細胞具有重要意義。同時，本研究也對前列腺癌治療的相關研究，特別是對去勢難治性前列腺癌的治療提供了一種新的靶向治療思路，即針對前列腺腫瘤干細胞進行靶向治療，從根源上治療前列腺癌。針對前列腺腫瘤干細胞的研究極具前景，本研究團隊將以此研究為基礎，今后繼續(xù)開展針對前列腺腫瘤干細胞靶向診斷及治療的相關研究，進而為前列腺癌的基礎研究提供一定的支持或參考。

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