王海峰 李培 王志遠(yuǎn) 林惜君 郭程 葉進(jìn)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中喉鱗狀細(xì)胞癌是其主要病理類型，占90%以上。雖然過去幾十年間喉癌的治療方式獲得了長足的進(jìn)展，但患者五年生存率卻沒有獲得提高，研究顯示1975年～2010年間美國喉癌患者的5年生存率從66%降到63%[1-2]。喉癌治療以外科手術(shù)為主，放化療是不可或缺的組成部分，近年來新型分子治療成為一種潛在選擇[1]。大量研究表明，諸多因子參與到的喉癌的腫瘤學(xué)進(jìn)程中，探明喉癌的分子機(jī)制對(duì)喉癌的早期診斷及研究新的分子靶標(biāo)至為重要[3-6]。微小RNA(miR)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，它們既可以作為促癌基因也可以作為抑癌基因[7-8]。近年來，miR在喉癌中的研究越來越多， 各種研究表明在喉癌的早期診斷、治療和預(yù)后等方面具有潛在作用[5]。目前miR-936偶見于其他腫瘤的報(bào)道中，但是尚未見miR-936在喉癌中的研究報(bào)道，本文主要討論miR-936對(duì)喉癌細(xì)胞株Hep-2的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

Hep-2細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 ng/ml)的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，每 1～2 d傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝

通過將合成好的pre-miR-936(F:CCGGTCAAGGCCACTGGGACAGTAGAGGGAGGAATCGCA-GAAATCACTCCAGGAGCAACTGAGAGACCTTCTAC-TTTACCAGGTCCTGCTGGCCCAGATTTTTG; R: AA-TTCAAAAATCTGGGCCAGCAGGACCTGGTAAAGTA-GAAGCAAGGTCTCTCAGTTGCTCCTGGAGTGATTT-CTGCGATTCCTCCCTCTACTGTCCCAGTGGCCTTGA)克隆到慢病毒載體pLKO.1-GFP質(zhì)粒中，構(gòu)建了miR-936慢病毒載體。將pLKO.1-GFP-miR-936與psPAX和pMD2G共轉(zhuǎn)染HEK293T，分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h收集培養(yǎng)液上清。收集濃縮的培養(yǎng)液上清，用濃縮的慢病毒(Lenti-miR-936)溶液感染Hep-2細(xì)胞，之后用嘌呤霉素篩選建立Hep-2的miR-936穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株及對(duì)照組細(xì)胞株(pLKO.1-GFP空載包裝病毒并感染Hep-2細(xì)胞)，分別稱為miR-936組及Vector組。

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

采用HiPure Total RNA Mini Kit(Magen)從Hep-2細(xì)胞中提取總RNA。采用HiFi-script cDNA kit(Cwbio)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(miR-936逆轉(zhuǎn)錄引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACCTGCGA)。以上所有操作遵照產(chǎn)品說明書。SYBR 熒光染料法RT-qPCR檢測Hep-2-miR-936穩(wěn)定株中miR-936的表達(dá)量，U6作為內(nèi)參RT-qPCR引物：miR-936(F): CACGCAACAGTAGAGGGA，miR-936(R)：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA；U6(F)：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6(R)：GTGCAGGGTCCGAGGT。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s； 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 20 s(共40個(gè)循環(huán))，所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，記錄系統(tǒng)返回的CT值，采用獲得相對(duì)定量結(jié)果。引物由Sangon Biotech訂購。

四、MTT實(shí)驗(yàn)

將Hep-2細(xì)胞以0.5×104～1×104/孔的密度接種到96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在增殖實(shí)驗(yàn)中分別在種板4 h、24 h、48 h、72 h、96 h后加入MTT(每孔終濃度0.5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO。在λ= 570 nm處測定吸光度。

五、劃痕實(shí)驗(yàn)

將Hep-2細(xì)胞(5×105/孔)接種到六孔培養(yǎng)皿中，直到細(xì)胞80%～90%匯合，吸盡培養(yǎng)液，先在皿底用黑線標(biāo)記，用10 μl移液槍吸頭在細(xì)胞單層上垂直于標(biāo)記線劃痕，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。使細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中遷移24 h和48 h，分別觀察并拍攝劃痕，選取3張圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，遷移的距離從顯微照片中測量。

六、Transwell小室實(shí)驗(yàn)

將Hep-2細(xì)胞接種在改良的Boyden室(Corning)的上部隔室中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。下室含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24 h。擦去膜上表面的細(xì)胞，并將侵入底部的細(xì)胞用10%結(jié)晶紫染色，然后隨機(jī)選取3個(gè)不同的視野拍攝并計(jì)數(shù)。

七、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)染色實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種在玻璃蓋板上24 h，然后用4%多聚甲醛固定20 min，并用0.1%Triton X-100在室溫下透化15 min。將蓋玻片在黑暗中用100 nM羅丹明-鬼筆環(huán)肽在室溫下孵育30 min。 之后用100 nM DAPI核復(fù)染。 將蓋玻片在PBS中沖洗并倒置晾干。然后將這些載玻片用中性香脂密封，并在共聚焦顯微鏡下觀察。

八、藥敏實(shí)驗(yàn)

將Hep-2細(xì)胞以0.5×104～1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育至其貼壁(一般4 h)，加入所屬濃度梯度的藥，繼續(xù)孵育72 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞狀態(tài)。加入10 μl MTT，而后繼續(xù)孵育4 h，吸盡培養(yǎng)基，加入50 μl DMSO，用搖床緩慢搖10 min，待結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測其吸光值(OD570)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、miR-936過表達(dá)Hep-2細(xì)胞株構(gòu)建

由于構(gòu)建的pLKO.1-GFP-miR-936質(zhì)粒以及空載pLKO.1-GFP包含熒光基因GFP，成功感染的Hep-2細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下能夠產(chǎn)生綠色熒光，未被感染的細(xì)胞則不能產(chǎn)生綠色熒光，因此比較同一光學(xué)顯微鏡視野下白光圖片及熒光圖片中細(xì)胞數(shù)量能夠判斷慢病毒感染效率，miR-936組感染效率為92%(細(xì)胞數(shù)量比值，熒光/白光=720/780)，Vector組感染效率為0.91(細(xì)胞數(shù)量比值，熒光/白光=510/560)(圖1A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-936組細(xì)胞的miR-936 mRNA表達(dá)水平高于Vector組(2.36±0.47vs1.00±0.10，t=5.600,P﹤0.05)，提示miR-936過表達(dá)的Hep-2穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功(圖1B)。

圖1 miR-936過表達(dá)Hep-2細(xì)胞株和對(duì)照組構(gòu)建(×100)

A:miR-936組與Vector組熒光表達(dá)情況；B: miR-936組與Vector組RT-qPCR檢測miR-936的表達(dá)；與Vector組比較，**P<0.01

二、過表達(dá)miR-936抑制Hep-2細(xì)胞增殖能力

將miR-936組和Vector組細(xì)胞等量接種于96孔板，2組細(xì)胞在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，0、4 h的MTT結(jié)果顯示2組接種量幾乎一致(t值分別為2.451和0.324，P均>0.05)，而在48、72、96 h，2組出現(xiàn)差異，miR-936組細(xì)胞增殖速度低于Vector組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.939、6.154、3.739，P均<0.05)。

三、miR-936抑制Hep-2細(xì)胞遷移能力

劃痕后細(xì)胞培養(yǎng)至24、48 h，miR-936組細(xì)胞的相對(duì)劃痕寬度均寬于Vector組(t值分別為8.071、6.318，P均﹤0.01)，提示miR-936過表達(dá)能夠減弱Hep-2細(xì)胞的遷移能力，見圖3。

四、miR-936抑制hep-2細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示， miR-936組細(xì)胞的穿膜數(shù)量少于Vector組(t=8.342，P<0.01)，提示miR-936過表達(dá)能夠減弱Hep-2細(xì)胞的侵襲能力。

五、miR-936抑制Hep-2細(xì)胞表面微管微絲表達(dá)

鬼筆環(huán)肽染色顯示miR-936組Hep-2細(xì)胞表面的微管微絲明顯少于Vector組(圖5)，miR-936組細(xì)胞表面微管微絲的減少提示其侵襲遷移能力的減弱。

圖2 miR-936對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響

*P<0.05，**P<0.01

六、miR-936增加Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的敏感性

與Vector組相比，miR-936組Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的敏感性增加(圖6)，DDP組0～100 μm的t值分別為0.000，-0.456，3.389，4.057，6.925，0.826，-2.782，2組在1、3、10 μm處比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；DOX組0～10 μm的t值分別為0.000，5.181，5.598，3.112，1.610，0.437，0.831，2組在0.03、0.1、0.3 μm處比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05 )。

圖3 miR-936對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響(×100)

A：2組細(xì)胞培養(yǎng)至0、24、48 h的相對(duì)劃痕寬度；B：2組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度比較，**P<0.01

圖4 miR-936對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響(×100)

A：Vector組；B： miR-936組；C：2組細(xì)胞的穿膜數(shù)量比較，**P<0.01

討 論

miR是一類具有控制基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平的能力的調(diào)控分子。miR通過降解mRNA或阻止mRNA翻譯來減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此，miR可以通過抑制其他促癌基因或者抑癌基因的基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)參與到腫瘤的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中。有系統(tǒng)性研究指出，在喉癌中有潛在診斷價(jià)值的miR有miR-196a，miR-21，miR-27a等，對(duì)預(yù)后評(píng)價(jià)有潛在價(jià)值的miR有miR-101、miR-126、miR-152、miR-19a等，而一些miR如miR-1、miR-129-5p、miR-155、miR-206等有可能是潛在的治療靶點(diǎn)[5]。

圖5 miR-936對(duì)Hep-2細(xì)胞微管微絲的影響(×600)

圖6 miR-936增加Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的敏感性

A：對(duì)順鉑的敏感性；B： 對(duì)阿霉素的敏感性；*P<0.05，**P<0.01

研究發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，miR-936在 子宮內(nèi)膜癌(EEC)和舌鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)[9-10]。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織中也有報(bào)道m(xù)iR-936呈現(xiàn)高表達(dá)[11-12]。另有研究發(fā)現(xiàn)與正常人相比，miR-936在肝細(xì)胞癌病人血液細(xì)胞微泡(Microvesicles)中高表達(dá)[13-14]。而另一項(xiàng)研究顯示miR-936在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(EPLC-32M1、A549和801D)和人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系(MiaPaCa-2、PANC-1和Hs766T)中呈現(xiàn)低表達(dá)[15-17]。由此可見，miR-936在不同腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中可能扮演著不同角色，而其在喉癌中扮演的角色及在喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的具體作用尚不可知。

本研究顯示，過表達(dá)的miR-936組Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的敏感性明顯增加，具體機(jī)制尚不清楚。而Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物斑蝥素(Cantharidin)可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF7中miR-936的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)一種對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞有抑制作用的強(qiáng)心苷類藥物(Amantadig)能夠升高腎細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-936的表達(dá)[19]。這些研究提示miR-936也可能作為抗腫瘤藥物的下游基因發(fā)揮抗腫瘤作用。因此miR-936有可能既直接增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性，同時(shí)也作為抗腫瘤藥物的下游基因發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了進(jìn)一步研究miR-936對(duì)喉癌細(xì)胞的作用，我們分別進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)以及鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-936明顯抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖能力(與Vector組相比較)。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-936能夠明顯抑制Hep-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且在鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-936組細(xì)胞表面微管微絲明顯減少。這些結(jié)果提示miR-936能夠抑制喉癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于N0期(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)胃癌組織，miR-936在N3期(超過7個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的胃癌組織中明顯低表達(dá)，提示miR-936低表達(dá)可能和胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與本研究發(fā)現(xiàn)的miR-936能夠抑制喉癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的結(jié)果相一致。

綜上所述，miR-936在不同腫瘤中可能有著不同的作用，本研究發(fā)現(xiàn)并初步驗(yàn)證了miR-936對(duì)于喉癌細(xì)胞系Hep-2的抑制作用，并從多個(gè)方面驗(yàn)證了miR-936作為抑癌基因抑制喉癌細(xì)胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲能力，并且增加其藥物敏感性，提示miR-936在喉癌治療中可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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