廣東省陽(yáng)江市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 陽(yáng)江 529500

當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑為我院婦科常用的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由山茱萸[1]等13味中藥組成，具有補(bǔ)血，益氣、填精功效、治氣血衰弱，腎精不足所致月經(jīng)后期、月經(jīng)過(guò)少、閉經(jīng)、痛經(jīng)、更年期綜合癥、不孕等癥。馬錢(qián)苷為方中主藥山茱萸的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、降血糖等多種功效[2]。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法，以水煎提取液中馬錢(qián)苷的含量和相對(duì)密度為考察指標(biāo)，對(duì)當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為其進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津公司LC-20AD高效液相色譜儀(LabSolutions色譜工作)站；SB25-12DTD型數(shù)控超聲清洗器(上海新芝生物科技股份有限公司)；AB 135-S十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多)；AB204-N型萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多)；超純水機(jī)(北京歷元電子儀器)。

1.2 材料 馬錢(qián)苷對(duì)照品(批號(hào)110640-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈(色譜純，批號(hào)：1307184A，默克股份兩合公司)；甲醇(色譜純，批號(hào)：1301095A，默克股份兩合公司)；所用試劑水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及生產(chǎn)實(shí)踐，當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑提取工藝采用水煎煮提取的方式，影響水提效果的主要因素為加水量(A)，提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)[3-4]。 選用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表

2.2 樣品提取液的制備 按處方比例稱(chēng)取9份混合中藥飲片，按擬定的正交試驗(yàn)方案進(jìn)行水煎煮提取。每份加水后均浸泡1 h，所得煎煮液濃縮至100 mL，相當(dāng)于每1 mL含生藥0.77 g。

2.3 相對(duì)密度 按《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則0601相對(duì)密度測(cè)定法測(cè)定。

2.4 馬錢(qián)苷含量測(cè)定[5-7]

2.4.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(10∶90)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫；25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。馬錢(qián)苷對(duì)照品，當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑樣品和缺山茱萸的陰性對(duì)照樣品的HPLC色譜。如圖1所示。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取馬錢(qián)苷對(duì)照品6.64 mg，置100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(質(zhì)量濃度為0.0664 mg/mL)。精密量取3 mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，置10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.0199 mg/mL)。

2.4.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下濃縮液各5 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取過(guò)濾液為供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成0.0066、0.0133、0.0199、0.0265、0.0332、0.0398 mg/mL的系列溶液，分別吸取上述溶液各10 μL，進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，以縱坐標(biāo)(Y)為峰面積，以橫坐標(biāo)(X)為質(zhì)量濃度(mg/mL)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=21905X-0.9030，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。線性范圍在0.0066～0.0398 mg/mL，呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積計(jì)算，RSD值為0.23%(n=6)。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別放置0、1、2、4、8、24 h后，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，RSD值為1.13%(n=6)，結(jié)果顯示在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性相對(duì)良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同批次樣品各6份，按“2.4.3”供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算馬錢(qián)苷含量，結(jié)果含量的RSD值為0.01%(n=6)，結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的同一批供試品溶液6份，分別加入相當(dāng)于各對(duì)照品溶液80%、100%和120%的量，在“2.4.1”色譜條件下檢測(cè)馬錢(qián)苷的回收率分別為99.13%、100.45%、100.93%，平均回收率為100.21 %；RSD值為3.68 %(n=6)，該方法回收率良好。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 水煎提取正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)，以馬錢(qián)苷含量和水提取液相對(duì)密度為主要考核指標(biāo)，設(shè)定權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4，綜合評(píng)分=(相對(duì)密度/最大相對(duì)密度)×0.4×100+(馬錢(qián)苷含量/最大馬錢(qián)苷含量)×0.6×100。研究選擇提取次數(shù)、加水量、提取時(shí)間為主要考察因素，由表3可見(jiàn)其影響順序?yàn)镃(提取次數(shù))>A(加水量)>B(提取時(shí)間)，水平影響次序?yàn)锳3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，故最佳提取工藝為A3B3C2。再經(jīng)方差分析結(jié)果(表4)可知提取次數(shù)(C)和加水量(A)對(duì)提取效果影響顯著，為主要因素，提取時(shí)間(B)對(duì)提取效果無(wú)明顯影響，為次要因素?？紤]節(jié)約成本，將B3調(diào)整為B2。調(diào)整最優(yōu)的提取工藝為A3B2C2，即8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h。

表3 水煎提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

注:F0.05(2,4)=6.94，F(xiàn)0.01(2,4)=18.00

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取與正交試驗(yàn)等量飲片3份，按優(yōu)選的提取工藝提取，測(cè)得相對(duì)密度的RSD為0.08%，馬錢(qián)苷含量RSD為0.81%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

有研究曾以方中君藥當(dāng)歸中的阿魏酸作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，發(fā)現(xiàn)阿魏酸含量測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證中專(zhuān)屬性不強(qiáng)，陰性對(duì)照液相色譜圖的干擾成分除了來(lái)自川芎的阿魏酸成分干擾，還來(lái)自其它藥材的阿魏酸成分干擾[9-10]。故沒(méi)有選擇當(dāng)歸中的阿魏酸為提取工藝指標(biāo)，而選擇臣藥山茱萸中的馬錢(qián)苷作為提取工藝的指標(biāo)。

山茱萸主要成分有環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，而馬錢(qián)苷是山茱萸補(bǔ)益肝腎的主要藥效物質(zhì)，且其水溶性和熱穩(wěn)定性相對(duì)良好，故研究選擇馬錢(qián)苷含量作為提取工藝主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分。另外方中飲片成分水溶性強(qiáng)，出膏率大，故選擇能反映出膏率大小的相對(duì)密度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，并在綜合加權(quán)評(píng)分賦予相對(duì)密度40%的比重。此外，綜合分析本組研究情況，精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)等結(jié)果均良好，正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果也準(zhǔn)確可靠，達(dá)到了優(yōu)選出當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑的最佳提取工藝的目的。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)養(yǎng)血合劑中山茱萸主要成分馬錢(qián)苷的最佳提取工藝為8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h，可作為后續(xù)相關(guān)提取研究的基礎(chǔ)和參考。

實(shí)驗(yàn)未對(duì)提取液的最佳pH條件進(jìn)行分析，僅以馬錢(qián)苷作為指標(biāo)成分和相對(duì)密度進(jìn)行優(yōu)選，研究仍存在一定局限性。但本次工藝研究最大的意義在于采用水溶液為提取溶劑，既能最大限度地節(jié)約成本，同時(shí)也能高效提取馬錢(qián)苷，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：36-37.

[2]劉洪，許惠琴.山茱萸及其主要成分的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(4)：254-256.

[3]張芹，蒲維婭，錢(qián)芳.開(kāi)胃合劑提取工藝研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2016,48(6)：61-63.

[4]張璐，仇繼璽，劉瑞新.柴芩合劑提取工藝研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014,29(4)：540-542.

[5]王凌，徐玲玲，符德玉.丹蛭合劑提取工藝研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2008,30(7)：1064-1065.

[6]王秀琴，王東興，徐春靜，等.HPLC法測(cè)定參萸清眩膏中馬錢(qián)苷的含量[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2017，14(4)：211-213.

[7]張燕，宋鵬飛.HPLC法測(cè)定清眩糖漿中馬錢(qián)苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4):353-354.

[8]東紅，劉毅.HPLC法測(cè)定復(fù)方益腎膠囊中馬錢(qián)苷的含量[J].天津藥學(xué)，2011,23(4)：15-16.

[9]劉云華，易進(jìn)海，黃志芳，等.川芎，當(dāng)歸藥材中總阿魏酸的含量測(cè)定[J].中成藥，2009，31(11)：1774-1776.

[10]譚亮，懂琦，肖遠(yuǎn)燦，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定枸杞子中5個(gè)酚酸類(lèi)成分的含量[J].藥物分析雜志，2013,33(3):376-381.