1.河北省遷安市中醫(yī)醫(yī)院，河北 遷安 064400；2.河北省遷安市人民醫(yī)院，河北 遷安 064400； 3.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050000

缺血性中風(fēng)所致腦損傷的病理機制尚不完全清楚，目前有多種研究，其中細胞調(diào)亡在缺血半暗帶損傷級聯(lián)反應(yīng)過程中起著十分重要的作用[1]，因此關(guān)于神經(jīng)細胞調(diào)亡機制的探索及基于抗調(diào)亡為靶點的治療藥物探究是缺血性中風(fēng)的研究熱點。金蛭方系課題組經(jīng)過多年篩選出的治療缺血性中風(fēng)的效方，臨床應(yīng)用10余年，療效明顯，但其作用機制不十分明確，本研究以期從細胞凋亡角度探討金蛭方對缺血性中風(fēng)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片(由遷安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備)，上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應(yīng)研磨冰片，所含生藥分別為：0.30 g/mL(高劑量)、0.15 g/mL(低劑量)。尼莫地平片(鄭州瑞康制藥有限公司提供，國藥準字：H41022175，規(guī)格：20 mg/片)。按體重0.00 1g/mL配制成水溶液。

Caspase-3(ab13585)，Bcl-2抗體(ab692)，Bax抗體(ab77566)，Actin 抗體(ab5694)，bolt 封閉液(ab184868)均由艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司提供。

1.3 主要儀器 DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽(濟南德高實驗室設(shè)備有限公司)，DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽(濟南德高實驗室設(shè)備有限公司)，LT-X型實驗室溫控搖床(Adolf Kuhner公司)，WH-300-LCD型電泳儀(上海雙琪生物科技有限公司)，AR0136-04型PVDF膜(博士德生物工程公司)。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[2]：頸部正中切口，用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎頸外動脈(ECA)遠端及枕動脈，在結(jié)扎線距分叉部2 mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進行結(jié)扎，將尼龍線經(jīng)頸總動脈(CCA)分叉部插入頸內(nèi)動脈(ICA)，此時松開CCA，ICA套線恢復(fù)血流，線栓推送順滑，無出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19 mm達到大腦中動脈開口處，將頸總動脈連同尼龍線一起結(jié)扎，縫合切口后外留尼龍線0.5 cm，放到單籠中，2 h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進行缺血后再灌注。參照Longa評定法，進行神經(jīng)功能缺損程度的評價，分為5個等級4分：0分，無明顯可見的缺損改變；1分，對側(cè)前肢可見屈曲、內(nèi)收；2分，向偏擁側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏雜側(cè)傾倒；4分，不能自主行走，意識不清；1～3分造模成功，0分與4分均為不合格模型，需要剔除。造模成功率100%。

1.5 實驗分組與給藥[3]60只大鼠自由進食飲水，飼養(yǎng)于18～22 ℃明暗各12 h的清潔級動物實驗室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組。①假手術(shù)組：手術(shù)時僅作頸部手術(shù)切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，術(shù)后當日灌服蒸餾水；②模型對照組(簡稱模型組)：造模當日灌服蒸餾水；③金蛭方低劑量組(簡稱低劑量組)：造模當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg(相當于成人劑量的10倍)；④金蛭方高劑量組(簡稱高劑量組)：術(shù)后當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg (相當于成人劑量的20倍)；⑤陽性藥尼莫地平片對照組(簡稱對照組)：術(shù)后當日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01g/kg (相當于成人劑量的20倍)。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 mL/100g計算，連續(xù)給藥2周。因給藥操作不當，模型組低劑量組各死亡1只大鼠，高劑量組死亡2只大鼠。

1.6 檢測方法 實驗2周末，于最后1次給藥禁食12 h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速斷頭冰浴中取右腦皮質(zhì)與白質(zhì)部分，濾紙吸干血跡，將大鼠皮質(zhì)部分放入凍存管，存入液氮中備用。

1.7 western-blot檢測蛋白含量

1.7.1 溶液配制 ①1.5M Tris-HC1(PH8.8)：準確稱量Tris堿18.15g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至8.8，定容至,100 mL。②1.0M Tris-HC1(PH6.8)；準確稱量12.1g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至6.8，定容至,100 mL。③10%過硫酸胺：準確稱量過硫酸胺0.1g溶于1 mL去離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。④10%SDS：180 mL水中溶解20g電泳級SDS，加熱至68 ℃水浴助溶，用濃鹽酸調(diào)至PH值至7.2，加水定容至200 mL。⑤Tris甘氨酸電泳緩沖液(5×)：準確稱量堿15.1 g，甘氨酸94 g，SDS5 g，適量去離子水溶解，定容至1000 mL。⑥電轉(zhuǎn)移緩沖液：準確稱量甘氨酸2.9g， Tris堿5.8 g，SDS0.37 g，甲醇200 mL，加去離子水定容至1000 mL。⑦TBS-T(0.05%)：準確稱量Tris堿2.42 g，NaCl8 g，適量去離子水溶解，鹽酸調(diào)PH值至7.6，Tween-20 0.5 mL，加水定容至1000 mL。

1.7.2 祥本蛋白提取 依照電泳上樣量需要，用水及5×loading buffer調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性5 min。

1.7.3 丙烯酰胺凝膠電泳 ①根據(jù)目的蛋白的分子量，配制15%的分離膠，5%濃縮膠。②待檢測蛋白樣品上樣量：上樣50 μg。③電泳條件；濃縮膠恒壓80 v，約20 min；分離膠恒壓120 v，電泳至溴酚藍到凝膠底部。

1.7.4 濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜 ①轉(zhuǎn)膜方法；準備一張大小合適的PVDF膜，浸泡于甲酵中30sec，再轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)液中，備兩張與膜大小一樣的厚濾紙浸泡于電轉(zhuǎn)液中備用；切除多余凝膠部分，按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序放入海綿墊夾層中，起盡氣泡。②轉(zhuǎn)膜條件：按照電流300 mA恒流轉(zhuǎn)膜；0.22 um孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間40 min

1.7.5 WB檢測目的蛋白 ①封閉；轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜浸泡于Western blot封閉液中，搖床中輕搖1 h。②一抗稀釋：用1%BSA/5%milk化稀釋一抗。③一抗孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜置于雜交袋中，加入2中配制好的一抗，用封膜機封口，4 ℃解育過夜。④洗膜；TBST洗膜3次，每次6 min。⑤二抗孵育：用Western blot封閉液稀釋二抗，羊抗兔-HRP、羊抗小鼠-HRP1：5000稀釋，室溫輕搖50 min。⑥洗膜：TBST洗膜3次，每次5 min。⑦ECL反應(yīng)、膠片曝光：將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1 min，暗室中曝光、顯影并定影。

2 結(jié)果

模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)；caspase-3、Bax蛋白表達較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)。用藥后各治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)。高、低劑量組在增強Bcl-2蛋白表達和降低caspase-3、Bax蛋白表達方面的作用優(yōu)于對照組(P<0.05)。詳見圖1，表1。

組別鼠數(shù)caspase-3BaxBcl-2假手術(shù)組120.204±0.017??0.241±0.026??0.943±0.031??模型組110.558±0.0420.667±0.0430.361±0.037高劑量組100.213±0.043??▲0.349±0.064??▲0.566±0.023??▲低劑量組110.295±0.063??▲0.342±0.0321??▲0.551±0.038??▲對照組120.416±0.037?0.457±0.0841??0.476±0.056??

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與對照組比較，▲P<0.05。

3 討論

課題組通過對中風(fēng)病臨床癥候?qū)W研究認為缺血性中風(fēng)患者多是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導(dǎo)致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡(luò)阻為本病的主要病機，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡(luò)為其有效治則，筆者根據(jù)金蛭方，研制院內(nèi)制劑“金蛭膠囊”(制劑號：冀藥制字Z20051013)治療缺血性中風(fēng)10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚，能散郁滯，順逆氣，上達高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫(yī)家認為其：“善治中風(fēng)，治風(fēng)圣藥”[4]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨行則勢弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡(luò)之功。

程序性死亡是保持細胞生存和死亡間平衡的關(guān)鍵因素。而凋亡作為程序性死亡的最主要類型，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點[5]。在缺血性腦損傷中，與壞死的細胞相比，凋亡細胞僅占死亡細胞總數(shù)的小部分[6]，而就缺血半暗帶而言，凋亡細胞死亡卻是最主要的死亡方式[7]。Caspase-3是Caspase家族成員之一，它在細胞調(diào)亡執(zhí)行階段中起著核心作用，活化的Caspase-3導(dǎo)致神經(jīng)元細胞DNA斷裂，抑制細胞増殖，并且破壞細胞之間的平衡狀態(tài)[8]。Caspase-3表達上調(diào)的細胞調(diào)亡是缺血性和出血性腦損傷的重要標志[9]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡過程中的調(diào)控基因，Bcl-2蛋白具有抑制細胞調(diào)亡的功能，Bax蛋白則具有促進細胞調(diào)亡的功能[10]。Bcl-2通過介導(dǎo)線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔道復(fù)合體的開放，抑制和調(diào)亡誘導(dǎo)因子AIF等促調(diào)亡蛋白的釋放阻止調(diào)亡的進程。Bax只有收到調(diào)亡信號刺激被激活后，發(fā)生分子構(gòu)造改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制調(diào)亡的蛋白對抗，阻止其抗調(diào)亡作用的發(fā)揮。因此，檢測caspase-3和Bcl-2、Bax缺血性卒中后的表達情況，即可說明細胞調(diào)亡的狀況。

本研究表明，缺血性中風(fēng)大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低。經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組可降低大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達表達，表明金蛭方通過調(diào)節(jié)caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達，以達到減輕腦缺血細胞凋亡、改善神經(jīng)功能、預(yù)防和治療缺血性中風(fēng)的作用，但其深入的作用機制有待進一步的探討。

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