彭瞰看，田 宇，楊 寧，呂 巖，趙 虎，宋春華，李海丹，徐慶華，蒼 晶

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與分子生物學(xué)研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

糖代謝是整個(gè)生物代謝的中心，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。當(dāng)植物經(jīng)冷馴化時(shí)，可通過(guò)可溶性糖的累積提高植物組織的抗寒能力；而可溶性糖累積的途徑之一就是通過(guò)糖代謝產(chǎn)生其他物質(zhì)和能源。已有報(bào)道認(rèn)為，糖代謝相關(guān)酶響應(yīng)植物冷脅迫；例如，青檀在低溫脅迫初期，體內(nèi)磷酸果糖激酶活性增強(qiáng)[1]；小麥幼苗受低溫脅迫時(shí)，葉綠體果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因表達(dá)量上調(diào)[2]；本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，冬小麥糖的積累以及糖代謝的關(guān)鍵酶基因表達(dá)與抗寒能力密切相關(guān)[3]。ABA是植物響應(yīng)各種非生物脅迫的重要因子，低溫下ABA對(duì)植物的糖代謝有一定的影響，例如，低溫脅迫下外施ABA的西瓜幼苗葉片可溶性糖含量顯著高于未施ABA的對(duì)照植株，并且其抗寒性更強(qiáng)[4]；本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也表明，外源 ABA 處理可不同程度地提高冬小麥糖酵解代謝相關(guān)酶的活性[5]。而ABA是如何通過(guò)調(diào)控糖代謝來(lái)應(yīng)答低溫脅迫的，目前少有報(bào)道。

miRNA 是一類在多種真核生物中調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA。近年來(lái)，大量miRNA陸續(xù)在植物中被發(fā)現(xiàn)，并且在非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用。研究表明，植物miRNA響應(yīng)低溫脅迫，如水稻miR319過(guò)表達(dá)能明顯下調(diào)其靶基因 PCF6和 TCP2的表達(dá)量，以此來(lái)增強(qiáng)植株對(duì)低溫的耐受性[6]；低溫脅迫下擬南芥miR397過(guò)表達(dá)突變體植株的抗寒性明顯提高，其下游響應(yīng)冷脅迫的CBF和COR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型[7]；本實(shí)驗(yàn)室之前也發(fā)現(xiàn)，在東農(nóng)冬麥1號(hào)中有多種miRNA與抗寒性相關(guān)[8-9]，且ABA對(duì) miRNA響應(yīng)低溫脅迫有影響[10]。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的冬小麥新品種東農(nóng)冬麥1號(hào)是首例能在黑龍江省高寒地區(qū)越冬(返青率85%以上)的強(qiáng)抗寒(可耐-30 ℃低溫)栽培品種[11]。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，從實(shí)驗(yàn)室已有的東農(nóng)冬麥1號(hào)的miRNA庫(kù)[12]中篩選出有表達(dá)差異而且可能與糖代謝相關(guān)的miRNAs及其靶基因，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，以探明miRNA介導(dǎo)糖代謝途徑響應(yīng)低溫脅迫的可能性，為揭示東農(nóng)冬麥1號(hào)強(qiáng)抗寒機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

強(qiáng)抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(hào)，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)于2015年9月7日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地進(jìn)行，完全區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，行長(zhǎng)2 m，行距0.2 m，10行區(qū)。播種量450?！-2，播深5 cm，常規(guī)管理。

待麥苗長(zhǎng)至三葉期，葉面噴施 10 mol·L-1ABA(本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)所得最適濃度)，噴施量4 m2·L-1，對(duì)照組噴施等量蒸餾水。待大田自然降溫，連續(xù)10 d最低溫度平均為5 ℃(對(duì)照溫度，2015年10月8日)、0 ℃(2015年10月27日)、-10 ℃(2015年11月23日)和-25 ℃(2016年1月11日)時(shí)，隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的麥苗，剪取分蘗節(jié)和葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 miRNAs前體序列的克隆

采用CTAB法提取分蘗節(jié)的基因組DNA，用RNase(康為世紀(jì)生物科技有限公司)純化DNA樣品。分別用1120a-T/1120-F和5049-3p-T/5049-3p-F(引物由哈爾濱博士生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增 tae-miR5049-3p和 tae-mi1120a 的前體序列。PCR體系與程序參考2×Taq Plus MasterMix(Dye)(康為世紀(jì)生物科技有限公司)說(shuō)明書，其中循環(huán)數(shù)為30，退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間為1 min。凝膠電泳檢測(cè)后，在miRNAs上下游引物的5’端分別加入特定序列g(shù)gcttaaU及 ggtttaaU，連接User載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol(康為世紀(jì)生物科技有限公司)法分別提取分蘗節(jié)與葉片的總RNA，利用Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit(寶生物工程(大連)有限公司)及Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)，進(jìn)行 cDNA第一鏈的合成。引物設(shè)計(jì)與合成均由哈爾濱博士生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 表達(dá)模式分析

運(yùn)用加尾法設(shè)計(jì)miRNAs成熟體序列的特異引物(即miRNA成熟體序列克隆引物，引物序列見表1)，利用Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(寶生物工程(大連)有限公司)對(duì)小麥分蘗節(jié)和葉片中mi5049-3P和miR1120a及其靶基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)分析，反應(yīng)體系與程序參考說(shuō)明書。其中miRNAs的表達(dá)量分析選用U6作為內(nèi)參基因，靶基因表達(dá)量分析選用Actin作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品每次反應(yīng)重復(fù)3次，以3次生物學(xué)重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[13]。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用RNAfold WebSever(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) 進(jìn)行 miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。利用WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) 對(duì)miRNAs成熟體序列的堿基保守性進(jìn)行分析。下載小麥miR5049-3p和miR1120a前體序列上游2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)，利用PlantCARE(http://bioinformatics .psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/) 預(yù)測(cè)miRNAs前體的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNAs前體序列與成熟體序列分析

根據(jù)miRbase(http://www.mirbase.org/)及Wheat URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)得到了miR5049-3p和miR1120a的前體及成熟體序列。以東農(nóng)冬麥1號(hào)的基因組DNA為模板，采用引物 5049-3pF/5049-3pR和1120aF/1120aR(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果二者均在170 bp左右有一條特異性條帶(圖1A)，測(cè)序結(jié)果表明二者均與數(shù)據(jù)庫(kù)中小麥 pre-miR5049-3p和 pre-miR1120a前體序列大小(分別為114 bp和120 bp)一致。利用RNAfold WebSever預(yù)測(cè)miRNA前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明 pre-miRNA5049-3p和 pre-miRNA1120a均能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。

表1 PCR所用引物序列Table 1 List of PCR primer sequences

圖1 miR5049-3p(A1)和miR1120a(A2)小麥前體及miR5049-3p(B1) 和miR1120a(B2)成熟體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of wheat precursor genes miR5049-3p(A1) and miR1120a(A2) and wheat mature genes miR5049-3p(B1) and miR1120a(B2)

以東農(nóng)冬麥1號(hào)的cDNA 為模板，分別用特異性引物5049-3pF1/mRQ 3′ Primer和1120aF1/mRQ 3′ Primer(由Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit提供)(表1)對(duì)成熟體序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)兩條miRNA均在100 bp處有一條特異性條帶(圖1B)，這與預(yù)測(cè)大小一致，可用于后期的表達(dá)量分析。對(duì)miR5049-3p和miR1120a的成熟體序列進(jìn)行堿基保守性分析，結(jié)果表明，其保守性較差，其中，miR5049-3p只在第1、2、11、16、17和18位的堿基保守性相對(duì)較高(圖3A)，其他堿基都不保守；miR1120a只在第4、7、11、16、22和23位的堿基保守性相對(duì)較高(圖3B)，其他堿基都不保守。比較而言，miR1120a的堿基保守性稍高于miR5049-3p。

圖2 miR5049-3p和miR1120a前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of miR5049-3p and miR1120a precursors

圖3 miR5049-3p(A)和miR1120a(B)成熟體序列堿基保守性分析Fig.3 Conservative analysis of nucleotides in mature body of miR5049-3p(A) and miR1120a(B)

圖4 分蘗節(jié)中miR5049-3p、miR1120a 和 6PGL、FBA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression of miR5049-3p,miR1120a,6PGL and FBA of tiller node under different temperature

2.2 低溫對(duì)miRNAs及其靶基因表達(dá)模式的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的miRNA及靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，分別找到了miR5049-3p和miR1120a的靶基因 6PGL和FBA，采用qRT-PCR 對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，miR5049-3p和miR1120a均能響應(yīng)低溫脅迫。

從圖4可以看出，在分蘗節(jié)中，隨著溫度降低，miR5049-3p的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化規(guī)律，0 ℃時(shí)達(dá)到峰值，而后持續(xù)降低；而miR1120a的表達(dá)量則呈“升-降-升”的變化規(guī)律，在0 ℃時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，-10 ℃、-25 ℃時(shí)的表達(dá)量也都高于5 ℃(圖4A)。miR5049-3p的靶基因6PGL的相對(duì)表達(dá)量隨著溫度的降低，先稍有升高，然后降低，-25 ℃時(shí)急劇上升；miR1120a的靶基因FBA的相對(duì)表達(dá)量隨著溫度的降低，在0 ℃時(shí)稍有升高，-10 ℃時(shí)急劇升高達(dá)到峰值，然后又迅速降低，但-25 ℃時(shí)仍然明顯高于5 ℃時(shí)的相對(duì)表達(dá)量(圖4B)。

從圖5可知，在葉片中，miR5049-3p的相對(duì)表達(dá)量呈先升后降的趨勢(shì)，-10 ℃時(shí)最高，5 ℃時(shí)最低；miR1120a則隨著溫度的降低其相對(duì)表達(dá)量持續(xù)升高。從整體上看 miRNAs的表達(dá)量呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)(圖5A)；靶基因6PGL和FBA的相對(duì)表達(dá)量正好分別與miR5049-3p和miR1120a呈負(fù)向變化，整體呈下降趨勢(shì)(圖5B)。這表明miRNAs與其靶基因可能存在負(fù)向調(diào)控的關(guān)系。

2.3 ABA對(duì)miRNAs及其靶基因在低溫下表達(dá)模式的影響

在外源ABA處理下，小麥分蘗節(jié)中的miRNAs和其對(duì)應(yīng)的靶基因相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)有明顯的變化。miR5049-3p和miR1120a的相對(duì)表達(dá)量隨著溫度的降低呈現(xiàn)“升-降-升”的變化規(guī)律，但從整體上看，各溫度下的 miRNAs相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(CK，水處理)；而它們靶基因的相對(duì)表達(dá)量均隨著溫度的降低而降低(6PGL在-25 ℃時(shí)稍有增高)，并明顯低于CK(表2)。這說(shuō)明，ABA可能調(diào)控了miRNAs的表達(dá)，從而響應(yīng)低溫。

圖5 葉片中 miR5049-3p、miR1120a 和 6PGL、FBA不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Expression of miR5049-3p,miR1120a,6PGL and FBA of leaf under different temperature

2.4 miRNAs前體啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的預(yù)測(cè)

miRNAs的表達(dá)受啟動(dòng)子調(diào)控，故運(yùn)用PlantCARE對(duì)小麥miR5049-3p和miR1120a前體啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥miR5049-3p和miR1120a的前體包含了TATA-box、CAATA-box等基本元件和多種應(yīng)答元件，它們響應(yīng)光反應(yīng)、激素、厭氧和低溫等多種環(huán)境因子，說(shuō)明這些環(huán)境因子均有可能調(diào)控miR5049-3p和miR1120a的表達(dá)(表2)，這與2.2及2.3的結(jié)果相呼應(yīng)，說(shuō)明低溫與ABA確實(shí)是miR5049-3p和miR1120a表達(dá)的影響因子。

3 討 論

近些年，人們對(duì)于植物在低溫脅迫下糖代謝的作用有了一定系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)[14]。大量研究表明，植物體內(nèi)可溶性糖含量在低溫下會(huì)發(fā)生變化[15-18]，抗寒性較強(qiáng)的植物可溶性糖含量會(huì)較高，其糖代謝相關(guān)酶的活性也會(huì)相應(yīng)變化，然而其具體響應(yīng)機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本研究從miRNA調(diào)控的角度出發(fā)，初步探究植物糖代謝響應(yīng)冷脅迫的機(jī)制，結(jié)果表明miR5049-3p和miR1120a可能靶向調(diào)控 6PGL和FBA的翻譯或沉默，從而介導(dǎo)小麥的糖代謝來(lái)響應(yīng)低溫脅迫。

6PGL是戊糖磷酸途徑(PPP)中的一種代謝酶，催化水解6-磷酸葡萄酸內(nèi)酯生成6-磷酸葡萄糖酸。已有研究表明，植物幼苗受低溫馴化時(shí)PPP途徑效率提高，能增強(qiáng)植物的抗凍性[19]。而該酶在PPP途徑中對(duì)應(yīng)答低溫的作用卻鮮有報(bào)道，僅有研究表明6PGL在擬南芥中可影響植株的大小[20]。本研究結(jié)果初步推測(cè)，6PGL對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)抗寒有著重要作用，5 ℃、0 ℃和-10 ℃時(shí)，其分蘗節(jié)中 6PGL基因的表達(dá)量變化不大，說(shuō)明PPP途徑還沒(méi)有對(duì)寒冷有所響應(yīng)；-25 ℃時(shí)， 6PGL相對(duì)表達(dá)量急速升高，使PPP途徑增強(qiáng)，一方面通過(guò)增加某些中間產(chǎn)物如Ru5P和NADPH等，為植物生物合成提供原料和專一性供體，確保ATP的生成和利用；另一方面，其PPP途徑的代謝終產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的累積也能增強(qiáng)細(xì)胞滲透壓，減小寒冷對(duì)細(xì)胞的傷害。

表2 不同溫度下外源 ABA 處理對(duì)小麥分蘗節(jié) miR5049-3p、 miR1120a 及其靶基因 6PGL、 FBA表達(dá)量的影響Table 2 Effect of exogenous abscisic acid on the expression of miR5049-3p, miR1120a, 6PGL,and FBA under different temperature

同一列數(shù)據(jù)后的字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

Different lower-case letters indicate significant difference at 0.05 level.

表3 miR5049-3p和miR1120a前體啟動(dòng)子區(qū)游順式作用元件Table 3 Cis-elements upstream in the promoter sequences of miR5049-3p and miR1120a

FBA是生物中非常關(guān)鍵的代謝酶，它參與了多個(gè)糖代謝途徑。近年的研究表明，植物的FBA與多種非生物脅迫密切相關(guān)，低溫、干旱、鹽等多種脅迫都能誘導(dǎo)FBA基因的表達(dá)[21-22]。已有報(bào)道表明，一些植物中的FBA基因?qū)τ诘蜏孛{迫有響應(yīng)[23-24]，但小麥FBA基因響應(yīng)冷脅迫的文獻(xiàn)還很少。本研究的初步結(jié)果表明，5 ℃和0 ℃時(shí)FBA的相對(duì)表達(dá)量變化不大，說(shuō)明此時(shí)FBA還沒(méi)有對(duì)寒冷作出明顯的應(yīng)答；-10 ℃時(shí)，F(xiàn)BA的相對(duì)表達(dá)量迅速升高,可能促進(jìn)多種糖代謝途徑：如糖異生、卡爾文循環(huán)等，一方面利于小麥體內(nèi)糖的累積，另一方面通過(guò)糖酵解來(lái)加速糖的消耗，糖酵解、PPP等代謝也能產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物和能量以供植株進(jìn)行次生代謝；而在-25 ℃時(shí)，F(xiàn)BA的相對(duì)表達(dá)量降低，但仍然比5 ℃ 時(shí)高，促進(jìn)果糖-1,6二磷酸裂解的程度減小，減慢糖酵解等消耗糖的代謝，以利于糖持續(xù)積累，增加細(xì)胞滲透壓，以減結(jié)冰對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)的傷害。本研究表明，F(xiàn)BA在-10 ℃ 開始響應(yīng)寒脅迫，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果也表明-10 ℃是東農(nóng)冬麥1號(hào)啟動(dòng)抗寒機(jī)制的關(guān)鍵溫度點(diǎn)[25]。

miR5049-3p和miR1120a是小麥的成熟miRNA[26-27]，分別屬于miR5049 和miR1120 基因家族，然而其在小麥中的作用并沒(méi)有具體的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR5049-3p和miR1120a是糖代謝的負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)東農(nóng)冬麥1號(hào)受到低溫脅迫時(shí)，分蘗節(jié)中的miR5049-3p和miR1120a因響應(yīng)環(huán)境低溫而表達(dá)降低，從而降低對(duì) 6PGL和FBA基因表達(dá)的抑制， 6PGL和FBA表達(dá)量升高，會(huì)增強(qiáng)糖代謝，從而為該品種提供能量及代謝產(chǎn)物，增強(qiáng)其抗寒性。隨著溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號(hào)葉片中miR5049-3p和miR1120a的相對(duì)表達(dá)量增高，其靶基因 6PGL和FBA的相對(duì)表達(dá)量下降，導(dǎo)致糖代謝下降，促使葉片逐漸衰老死亡。

ABA可以作為植物響應(yīng)冷脅迫的信號(hào)分子，外源施加ABA可以通過(guò)降低植物呼吸速率，提高糖的累積來(lái)增加植物的抗寒性，同時(shí)外施ABA也可通過(guò)調(diào)控miRNAs的表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))來(lái)調(diào)節(jié)植物的抗寒性。本研究中，外施ABA后，miR5049-3p和miR1120a的相對(duì)表達(dá)量增高，從而增加了對(duì) 6PGL和FBA基因表達(dá)的抑制，進(jìn)而降低東農(nóng)冬麥1號(hào)整體糖代謝及呼吸速率，使糖積累，增加滲透壓，從而減小結(jié)冰傷害。本課題組前期的研究表明，不同的miRNA可能調(diào)控同一個(gè)靶基因[28]，本研究也發(fā)現(xiàn)外施ABA條件下，-10 ℃時(shí)miRNAs的表達(dá)量降低，但其靶基因的表達(dá)量并沒(méi)有上升，這可能是由于ABA引起了其他能夠靶向調(diào)控 6PGL和FBA的 miRNAs的表達(dá)。同時(shí)，還可以進(jìn)一步依此研究其他環(huán)境因子條件下miRNAs及其靶基因的表達(dá)變化。

綜上，低溫下東農(nóng)冬麥1號(hào)的miR5049-3p和miR1120a可能分別負(fù)向調(diào)控其靶基因 6PGL和FBA，進(jìn)而介導(dǎo)糖代謝響應(yīng)低溫脅迫。ABA可能通過(guò)調(diào)控miRNAs而影響其靶基因，進(jìn)而調(diào)控小麥抗寒性。

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