折劍青，婁博文，吳 岳，袁祖貽

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內科， 陜西 西安 710048)

促紅細胞生成素(erythropoirtin，Epo)是一種糖蛋白復合物，在成人體內主要由肝臟及腎臟分泌。既往研究提示，Epo在抑制前成紅細胞凋亡及促進紅細胞生成方面起到至關重要的作用[1-3]。近年來有研究提示，Epo在造血以外系統(tǒng)，包括腎臟病理、神經發(fā)育和氧化應激等方面同樣起到重要調節(jié)作用[3-5]，人類及小鼠腎臟細胞中都可以檢測到Epo的表達，提示Epo可能在腎臟疾病中發(fā)揮作用[6]；進一步研究表明，Epo的單核苷酸多態(tài)性遺傳改變在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中產生一定影響[7]；此外，在糖尿病腎病小鼠中持續(xù)給予Epo受體(Epo receptor，EpoR)激動劑可明顯減少腎臟細胞凋亡和壞死的數量[8]，以上研究均提示Epo可能在腎臟病理生理改變中起到作用。然而，Epo在腎臟病理改變中的具體作用和機制仍有待進一步闡明。此外，由于Epo在造血系統(tǒng)具有至關重要的作用，Epo基因敲除或下調的動物模型很難在胚胎期以后存活[9]，也限制了對Epo功能的進一步在體觀察。

本研究中，我們采用斑馬魚作為動物模型觀察Epo基因下調對斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)的影響。斑馬魚作為一種新興的動物模型具有易于調控基因表達、胚胎期透明易于活體觀察及用于觀察的胚胎數目多等特點[10]。胚胎受精后48～72 h，斑馬魚前腎單位由單一的2個腎小球組成，兩者分別與雙側腎小管連接，隨著胚胎發(fā)育，2個腎小球在中線融合；而在人體，腎臟發(fā)育較斑馬魚涉及更為復雜的步驟及器官。既往研究提示，斑馬魚腎臟細胞與人類腎臟細胞存在高度同源性，通過對斑馬魚胚胎腎臟的形成、發(fā)展及病理機制的研究，可以為人類腎臟疾病發(fā)生發(fā)展起到指導作用[11]。

本文通過觀察Epo及其受體EpoR基因表達下調條件下，斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)改變，進一步探索可能的機制及信號通路，以期了解Epo在腎臟發(fā)育及病理改變中的可能作用，并為腎臟疾病的診治提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 動物

采用腎臟顯像的Tg(wt1b:EGFP)品系斑馬魚。使用E3標準培養(yǎng)液(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和5%～10% 亞甲藍)進行斑馬魚胚胎培育，培育溫度28.5 ℃。使用0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU； Sigma)抑制斑馬魚胚胎黑色素產生，進而在胚胎受精后48 h (48 hours post-fertilization，48 hpf)進行觀察。

2 主要試劑

Epo[12]和EpoR[13]嗎啉序列由既往研究獲得并由Gene Tools合成。使用ApopTag? Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)進行TUNEL凋亡染色；使用Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒(BD)進行Annexin V凋亡染色;抗蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)抗體購于Cell Signalling Technology。

3 主要方法

3.1斑馬魚胚胎嗎啉注射 基因下調注射用Epo及EpoR嗎啉濃度分別為4和6 g/L，使用 0.1 mol/L KCl作為溶質進行嗎啉注射液配制。將1 nL相應基因的嗎啉注射液在斑馬魚胚胎單細胞或雙細胞期進行注射，從而實現Epo及EpoR基因的下調。

3.2血紅蛋白染色 斑馬魚胚胎48 hpf分別對Epo及EpoR基因表達下調及正常對照斑馬魚進行血紅蛋白染色，即鄰聯茴香胺(o-dianisidine)染色，染色方法見既往報道[12]。

3.3TUNEL染色 斑馬魚胚胎去卵黃囊，在4 ℃新鮮配制的4% PFA/PBS中隔夜固定，其后使用PBST(1×PBS/0.1% Tween-20)清洗，使用25%、50%和75%濃度梯度甲醇溶劑進行脫水后隔夜置于-20 ℃ 100%甲醇中。次日使用75%、50%、25%濃度梯度甲醇進行水化，后在10 mg/L，蛋白酶K(Roche)中浸泡21 min。將處理后斑馬魚胚胎依照既往TUNEL染色步驟進行染色[14]。

3.4Annexin V染色及流式細胞術分析 斑馬魚胚胎在48 hpf去胚膜，在Ringer試劑(116 mmol/L NaCl、2.9 mmol/L KCl和5 mmol/L HEPES，pH 7.2)，中浸泡15 min，后在PBS中清洗2次，使用0.25%胰蛋白酶反應15～20 min，后使用含10% 胎牛血清及2 mmol/L CaCl2的PBS溶液停止反應。離心沉淀細胞，使用PBS清洗2次，后溶于Annexin V染色緩沖液中，加入APC熒光標記的Annexin V及7-AAD (Beckman Coulter)。使用BD FACS Canto II流式細胞儀進行流式細胞術測定。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)陽性細胞為斑馬魚胚胎腎臟細胞，GFP陰性細胞屬于除腎臟以外的斑馬魚其它組織。定量分析不同染色的細胞：Annexin V染色陽性、7-AAD染色陰性細胞為早期凋亡細胞；Annexin V染色陽性、7-AAD染色陽性細胞為晚期凋亡細胞；Annexin V染色陰性、7-AAD染色陰性細胞為壞死細胞。使用Epo和EpoR基因下調的斑馬魚胚胎相對對照組胚胎的細胞比進行后續(xù)量化分析。

3.5顯微鏡分析 Tg(wt1b:EGFP)品系斑馬魚胚胎去胚膜，使用0.05 % tricaine (Sigma)麻醉,使用1%低融點瓊脂固定胚胎。使用Leica DFC420 C熒光照相機進行斑馬魚腎臟免疫熒光成像，并使用TCS SP5 system (Leica)進行共聚焦顯微鏡成像。

3.6Western blot實驗 收集48 hpf斑馬魚胚胎進行蛋白提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度， Western blot實驗方法見既往報道[14]。

3.7RNA提取及real-time PCR驗證 使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取斑馬魚胚胎mRNA。使用SuperScript II Kit (Invitrogen)合成cDNA。使用Roche Universal Probe Library Assay Design Center 進行實時定量PCR引物設計(https://lifescience.roche.com/en_cn/brands/universal-probe-library.html)。Epo上游引物序列為5’-TAGGACGCGCAGGTCACAGATG-3’，下游引物序列為5’-AAACCATCTGTGACCTGCGCGT-3’；EpoR上游引物序列為5’-GCAAGCTGCTTAAGCTCCAA-3’，下游引物序列為5’-AAATCAATGAGTCCCAACAGC-3’。使用β-actin作為內參照，上游引物序列為5’-ACGGTCAGGTCATCACCATC-3’，下游引物序列為5’-TGGATACCGCAAGATTCCAT-3’。使用Roche LightCycler? 480進行PCR擴增反應。反應條件為：95 ℃ 2 min； 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)； 72 ℃ 7 min。

4 統(tǒng)計學處理

使用Leica LAS V4.8軟件進行腎臟形態(tài)量化分析,腎小球長度及頸部長度以μm為單位。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間的數據比較根據數據方差齊性使用Student’st-test或Mann-WhitneyU-test進行統(tǒng)計分析，3組數據間的比較使用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Epo及EpoR基因下調導致斑馬魚胚胎腎臟細胞發(fā)育異常

首先，我們使用了先前已經驗證過的嗎啉(圖1C)，通過剪接阻斷斑馬魚Epo的表達(圖1D)，觀察Epo基因下調后斑馬魚腎臟形態(tài)改變。為了進一步確認已發(fā)表的Epo嗎啉功能，我們將4 ng的Epo嗎啉在斑馬魚胚胎單細胞期進行注射，并通過48 hpf的血紅蛋白染色證實，Epo基因下調后斑馬魚中血紅蛋白含量較對照組顯著減少(圖1A)，該實驗進一步明確了所用Epo嗎啉的有效性。接下來，我們分析了Epo基因表達下調對48 hpf斑馬魚胚胎前腎單位的形態(tài)影響。Tg(wt1b：EGFP)品系斑馬魚胚胎前腎單位可通過熒光顯微鏡對EGFP陽性細胞進行觀察記錄而獲得，在48 hpf，斑馬魚胚胎形成前腎結構，其中包括后期融合的兩側腎小球及兩側連接在后面形成管狀結構的頸部。我們發(fā)現注射Epo嗎啉導致48 hpf斑馬魚前腎單位形態(tài)改變，表現為腎小球長度顯著增加和頸部長度減少(P<0.01),見圖1A、B。

我們進一步探索EpoR基因表達下調是否可以導致腎臟形態(tài)發(fā)生類似改變。使用既往報道過的EpoR嗎啉(圖2C)在Tg(wt1b:EGFP)斑馬魚胚胎單細胞期進行注射，通過血紅蛋白染色證實其有效性，并在48 hpf進行熒光顯微鏡下腎臟形態(tài)觀察。研究結果提示EpoR基因表達下調(圖2D)后，48 hpf斑馬魚胚胎血紅蛋白染色較對照組減少(圖2A)，進一步證實EpoR嗎啉有效。與此同時，EpoR基因下調也導致斑馬魚前腎單位形態(tài)改變，其量化結果與Epo基因下調一致，見圖2A、B。上述結果表明，Epo通過與EpoR結合，在斑馬魚腎臟發(fā)育及維持正常腎臟形態(tài)中起到重要作用。

Figure 1.Epoknockdown resulted in kidney structure alteration in zebrafish pronephros. A: pronephros alterations and loss of hemoglobin inEpomorphants as compared with control group (white scale bar=200 μm; black scale bar ino-dianisidine staining=500 μm); B: the quantitative analysis of A in three independent experiments; C: morpholino sequence and targets ofEpo; D: the relative mRNA level of Epo inEpomorphants as compared with control group in three independent experiments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1Epo基因下調導致斑馬魚腎臟形態(tài)改變

Figure 2.EpoRknockdown resulted in kidney structure alteration in zebrafish pronephros. A: pronephros alterations and loss of hemoglobin inEpoRmorphants as compared with control group (white scale bar=200 μm; black scale bar ino-dianisidine staining=500 μm); B: the quantitative analysis of A in three independent experiments; C: morpholino sequence and targets ofEpoR; D: the relative mRNA level of EpoR inEpomorphants as compared with control group in three independent experiments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2EpoR基因下調同樣導致斑馬魚腎臟形態(tài)改變

2 Epo及EpoR基因下調引起斑馬魚腎臟凋亡及壞死細胞增多

目前數據結果提示，Epo與EpoR結合并發(fā)揮后續(xù)作用，對于斑馬魚腎臟正常形態(tài)發(fā)育起到重要作用。但是Epo和EpoR如何發(fā)揮作用保證腎臟形態(tài)正常發(fā)育尚未明確。結合既往Epo通過結合EpoR從而抑制前紅細胞凋亡相關報道[1, 4]，我們推測，Epo在腎臟細胞中同樣起到抗凋亡的作用。

使用TUNEL染色對Epo及EpoR基因敲減斑馬魚胚胎進行凋亡細胞染色。實驗結果提示Epo及EpoR基因下調后48 hpf斑馬魚胚胎體內凋亡細胞較對照明顯增多。值得注意的是，腎臟組織的凋亡細胞較對照組亦明顯升高(P<0.01)，以上結果提示Epo與EpoR基因敲減誘導腎臟細胞凋亡，進而引起腎臟結構形態(tài)改變，見圖3。

為了進一步證實TUNEL凋亡染色的結果，我們使用Annexin V染色并通過流式細胞術進一步篩選比較腎臟組織中凋亡細胞的比例，見圖4A。比較早期腎臟凋亡細胞(即GFP陽性、7-AAD陰性和APC-Annexin陽性細胞)比例，可發(fā)現Epo基因下調后早期凋亡細胞比例顯著升高，而EpoR基因下調胚胎無明顯變化，見圖4B；與此同時，晚期腎臟凋亡細胞(即GFP陽性、7-AAD陽性和APC-Annexin陽性細胞)比例在Epo和EpoR基因下調后均較對照組顯著升高，見圖4C；最后，我們進一步比較了壞死腎臟細胞(即GFP陽性、7-AAD陽性和APC-Annexin陰性細胞)比例，發(fā)現僅EpoR基因下調胚胎腎臟中，壞死細胞較對照組明顯升高，見圖4D。以上結果提示Epo與EpoR基因敲減均導致48 hpf斑馬魚胚胎腎臟細胞凋亡增多，但Epo基因下調主要引起早期及晚期凋亡細胞增多，EpoR基因下調則導致晚期凋亡細胞及壞死細胞增多。

3 Epo及EpoR基因下調降低Akt磷酸化水平

既往研究提示，Epo通過與EpoR結合，進而抑制PI3K/Akt信號通路，抑制Akt去磷酸化，保護前紅細胞免于細胞凋亡，從而糾正貧血[15-16]。本研究目前證實，斑馬魚前腎單位中，Epo和EpoR基因下調，同樣可導致腎臟細胞凋亡，進而引起腎臟細胞形態(tài)改變。于是我們進一步探索，Akt去磷酸化是否在Epo基因表達下調引起細胞凋亡中同樣起到作用。Western blot結果提示，Epo及EpoR基因表達下調后48 hpf斑馬魚胚胎中，p-Akt較對照組明顯減少,見圖5A。這表明Akt去磷酸化在Epo及EpoR基因敲減導致斑馬魚腎臟細胞凋亡中可能起到重要做用。

Figure 3. Knockdown ofEpoandEpoRresulted in increased apoptotic cells within pronephros in 48 hpf zebrafish embryos measured by TUNEL assay (white scale bar=100 μm). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3TUNEL染色顯示Epo及EpoR基因敲減導致斑馬魚腎臟細胞凋亡

綜上所述，我們的研究結果發(fā)現，Epo及EpoR基因下調可引起Akt去磷酸化，進一步導致腎臟凋亡細胞增多及腎臟結果形態(tài)改變，Epo在斑馬魚腎臟發(fā)育及形態(tài)結構中起到重要調節(jié)作用，見圖5B。

討 論

1 Epo在斑馬魚胚胎腎臟發(fā)育中的作用

本研究發(fā)現Epo通過抑制凋亡在斑馬魚腎臟發(fā)育及形態(tài)結構中起到重要調節(jié)作用。本結論主要基于以下觀察結果：(1)Epo和EpoR基因表達下調引起斑馬魚胚胎的腎臟結構和功能改變；(2)Epo和EpoR基因表達下調引起斑馬魚胚胎的腎臟凋亡及壞死細胞增多；(3)Epo和EpoR基因表達下調引起斑馬魚體內Akt磷酸化水平降低。

Epo在既往研究中被公認為造血系統(tǒng)重要的調節(jié)因子，進來研究提示Epo與腎臟病變尤其是糖尿病腎病的發(fā)生相關，Epo的單核苷酸多態(tài)性遺傳改變在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中產生一定影響[17]。又有研究指出，糖尿病腎病小鼠中持續(xù)給予EpoR激動劑，可明顯減少腎臟細胞凋亡和壞死的數量[8]。然而，以上研究僅闡明了補充Epo或刺激Epo受體，可能起到保護腎臟功能的作用，并未進一步闡明Epo與腎臟病變的直接關系。本研究中，通過下調Epo及EpoR基因的表達，我們發(fā)現Epo表達下調可直接引起斑馬魚腎臟形體改變，Epo通過結合EpoR，誘導Akt去磷酸化，進而導致腎臟細胞凋亡壞死，并直接導致斑馬魚胚胎腎臟形態(tài)改變。其次，由于Epo主要在人類腎間質細胞中產生，傳統(tǒng)觀點通常認為Epo濃度降低是終末期腎衰竭的結果[15]。然而，我們的研究同時表明，低濃度Epo是腎臟結構惡化的直接原因。通過觀察Epo及EpoR基因下調的斑馬魚腎臟形態(tài)，我們發(fā)現，Epo及EpoR表達下降可直接引起腎臟形態(tài)改變。在機制上，我們證明在斑馬魚整個胚胎以及前腎單位中，均檢測到增加的凋亡細胞。以上結果提示Epo表達下調不僅是腎臟病變的結果，同時也是腎功能受損的原因。在終末期腎衰竭中，腎功能不全引起Epo水平下降，可能進而導致腎臟功能進一步下降，形成雙向調節(jié)作用。

Figure 4. Knockdown ofEpoandEpoRincreased apoptotic and necrotic cells in different patterns within pronephros in 48 hpf zebrafish embryos analyzed by flow cytometry with Annexin V staining. A: the images of flow cytometry analysis with Annexin V staining forEpoandEpoRmorphants as compared with control group; B: the quantitative analysis of early apoptotic cells in three independent experiments; C: the quantitative analysis of late apoptotic cells in three independent experiments； D: the quantitative analysis of necrotic cells in three independent experiments. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4Epo和EpoR基因下調在斑馬魚腎臟細胞凋亡和壞死中起到不同作用

此外，Annexin V染色結果提示，Epo及EpoR基因敲減在細胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死中起到不同作用：Epo基因敲減主要引起斑馬魚胚胎腎細胞早期及晚期凋亡，而EpoR基因敲減主要引起腎細胞晚期凋亡及壞死。既往研究指出，循環(huán)中Epo與靶細胞表面Epo受體結合，并發(fā)揮其后續(xù)作用，因此，EpoR基因敲減導致腎臟細胞凋亡壞死，可能早于Epo發(fā)揮作用。

Figure 5. Knockdown ofEpoandEpoRdecreased Akt phosphorylation and overall schematic illustration. A: decreased Akt phosphorylation uponEpoandEpoRknockdown shown by Western blot; B: schematic illustration that Epo and EpoR maintain kidney structure and function through repressing apoptosis.

圖5Epo和EpoR基因下調減弱斑馬魚Akt磷酸化及機制假設

2 斑馬魚作為生物模型對胚胎期腎臟形態(tài)進行觀察

本研究成功使用斑馬魚作為生物模型生物，通過對腎臟結構進行胚胎期的形態(tài)觀察，進一步分析腎臟疾病發(fā)病機制。與其它模型生物相比，斑馬魚具有胚胎身體透明可視化程度高、與人類基因組相似度高，以及易于基因表達操縱等特點[10]。胚胎受精后48～72 h，斑馬魚前腎單位由單一的兩個腎小球組成，并與雙側腎小管連接，形成基本的腎單位。斑馬魚胚胎腎臟的結構簡單，但與人類腎單位具有一致性及同源性，這一特點使得斑馬魚的腎臟研究具有結構簡單、觀察便捷、便于對活體胚胎腎臟進行形態(tài)觀察等特點[11]。此外，本研究通過對斑馬魚的腎小球及腎小管的長度記錄比較，提供了一種斑馬魚腎臟形態(tài)量化分析的新手段。

綜上所述，本研究通過觀察Epo及EpoR基因下調條件下斑馬魚胚胎腎臟的形態(tài)改變，提出Epo及EpoR可直接引起斑馬魚腎臟結構發(fā)育異常，進一步研究發(fā)現，Akt去磷酸化增強引起腎臟細胞凋亡增多可能起到重要作用。本研究為Epo的造血系統(tǒng)以外作用提供了新的證據支持，并提示阻止Epo表達下調可能是治療腎臟疾病的新靶點。

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