曹瑞萍，王 嬌，王 策

(深圳市人民醫(yī)院 1急診科， 2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心， 廣東 深圳 518020)

帕金森病(Parkinson disease，PD)又名震顫麻痹，是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失和紋狀體多巴胺含量的顯著降低，臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動遲緩和姿勢反射障礙等。大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)和加劇PD的主要原因[1],因此抗氧化應(yīng)激成為治療PD的有效途徑。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)信號通路是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路，在清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的過程中發(fā)揮重要作用[2]?；ń?zerumbone，ZER)是從姜科植物紅球姜中提取的倍半萜化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化等藥理作用[3-4]。近來有研究證實(shí)，花姜酮可通過激活Nrf2/HO-1信號通路減輕紫外線、脂多糖以及佛波酯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[4-6]。這提示花姜酮具有治療神經(jīng)退行性疾病的潛力，但目前尚無相關(guān)報道。本研究采用1-甲基-4-苯基-吡啶鎓離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型[7]，觀察花姜酮對該細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用，為探究PD發(fā)生發(fā)展的可能分子生物學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)性資料。

材 料 和 方 法

1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone；抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)、ZER和MPP+購自Sigma；CCK-8、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、TRIzol試劑、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；人帕金森病蛋白7(Parkinson disease protein 7，PARK7)基因干擾質(zhì)粒(pRS-PARK7)和無義對照質(zhì)粒(pRS-scrambled)購自O(shè)rigene；脂質(zhì)體Lipofectamine? 2000購自Invitrogen；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；兔抗人PARK7、Nrf2、血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底達(dá)80%以上時，以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2藥物配制 將ZER溶于DMSO制成20 mmol/L的儲備液，分裝后于-20 ℃儲存。使用時用細(xì)胞培養(yǎng)液將儲備液稀釋成所需濃度的工作液，DMSO終濃度為0.05%。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分別經(jīng)MPP+(100、200、300、400、500和600 μmol/L)單獨(dú)作用12、24 和48 h，或者先加入ZER(2、5和10 μmol/L)作用2 h后再加入600 μmol/L MPP+繼續(xù)作用24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長處吸光度(A)值，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零孔和對照孔。細(xì)胞活力(%)=加藥孔A值/對照孔A值×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分成4組：(1)對照(control)組：繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞24 h；(2)MPP+組：用600 μmol/L MPP+作用24 h；(3)ZER+MPP+組：提前2 h加入10 μmol/L ZER，然后加入600 μmol/L MPP+繼續(xù)作用24 h；(4)NAC+MPP+組：提前2 h加入5 nmol/L NAC，再加入600 μmol/L MPP+繼續(xù)作用24 h；各組DMSO終濃度均為0.05%，每組設(shè)3個復(fù)孔。收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于含有10 μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，再用PBS漂洗2次，流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)樣本的熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)代表ROS含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組同2.4，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min。100×g離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞于預(yù)冷的結(jié)合緩沖液中，加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光保存，立即用流式細(xì)胞儀分析檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將質(zhì)粒pRS-PARK7和pRS-scrambled分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine? 2000操作說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染pRS-PARK7質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞為干擾(shPARK7)組，轉(zhuǎn)染pRS-scrambled質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞為陰性對照(shControl)組。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)36 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.7Western blot法檢測蛋白水平 用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入 I 抗(抗PARK7、Nrf2和HO-1抗體均以1∶1 000稀釋，抗β-actin抗體以1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)100、200、300、400、500和600 μmol/L的MPP+分別作用12、24和48 h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，隨著MPP+濃度和作用時間的增加，SH-SY5Y細(xì)胞活力逐漸下降(P<0.05)，表明MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞具有顯著的毒性作用，且具有時間和劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. The effect of MPP+on the viability of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs200 μmol/L group;△P<0.05vs400 μmol/L group;▲P<0.05vs12 h group;&P<0.05vs24 h group.

圖1MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

2 ZER減輕MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用

采用600 μmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h作為細(xì)胞損傷模型。為明確ZER對SH-SY5Y細(xì)胞是否具有保護(hù)作用，我們提前2 h加入ZER(終濃度為2、5和10 μmol/L)，再加入MPP+。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MPP+組相比，SH-SY5Y細(xì)胞的活力隨著ZER濃度的增加而升高(P<0.05),表明ZER可減輕MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，見圖2。

Figure 2. The effect of ZER on the viability of MPP+-treated SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs600 μmol/L MPP+group;△P<0.05vs600 μmol/L MPP++ 2 μmol/L ZER group;▲P<0.05vs600 μmol/L MPP++ 5 μmol/L ZER group.

圖2ZER對MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

3 ZER對PARK7和Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，MPP+組的PARK7和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與MPP+組相比，隨著預(yù)先加入ZER濃度的增加，ZER+MPP+組的PARK7和Nrf2蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05),表明ZER可劑量依賴性地阻斷MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞PARK7和Nrf2蛋白表達(dá)的抑制作用,見圖3。

Figure 3. The effect of ZER on protein levels of PARK7 and Nrf2 in MPP+-treated SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs600 μmol/L MPP+group;△P<0.05vs600 μmol/L MPP++ 2 μmol/L ZER group;▲P<0.05vs600 μmol/L MPP++5 μmol/L ZER group.

圖3ZER對MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中PARK7和Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響

4 ZER對細(xì)胞中ROS含量的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化,結(jié)果顯示,與對照組相比，MPP+組的MFI顯著升高(P<0.05)；與MMP+組相比，ZER+MPP+組和NAC+MPP+組的MFI均顯著降低(P<0.05),表明ZER和NAC可抑制MPP+引起的ROS生成,見圖4。

Figure 4. The effect of ZER on ROS production in MPP+-treated SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPP+group.

圖4ZER對MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中ROS含量的影響

5 ZER抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了ZER對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示,與對照組相比，MPP+組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與MPP+組相比，ZER+MPP+組和NAC+MPP+組的細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05),表明ZER和NAC可抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，見圖5。

6 沉默PARK7基因?qū)rf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

為探究PARK7與Nrf2/HO-1通路的關(guān)系，我們采用小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)特異性抑制PARK7基因表達(dá)以觀察Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的變化。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shControl相比，shPARK7組的PARK7蛋白水平明顯下降(P<0.05)，說明干擾質(zhì)粒pRS-PARK7成功抑制了PARK7基因的表達(dá)；與此同時，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平也明顯下降(P<0.05)，表明PARK7位于Nrf2/HO-1通路的上游，見圖6。

Figure 5. The effect of ZER on the apoptosis of MPP+-treated SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPP+group.

圖5ZER對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6. The effect ofPARK7 silencing on the protein levels of Nrf2 and HO-1 in the SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖6沉默PARK7基因?qū)rf2和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

7 沉默PARK7基因?qū)OS含量和細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與shControl組相比，shPARK7組的MFI和細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，表明抑制PARK7基因表達(dá)可增加SH-SY5Y細(xì)胞中ROS的含量并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，見圖7、8。

Figure 7. The effect ofPARK7 gene silencing on ROS level in the SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖7沉默PARK7基因?qū)OS含量的影響

Figure 8. The effect ofPARK7 gene silencing on the apoptosis of the SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖8沉默PARK7基因?qū)?xì)胞凋亡的影響

討 論

人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y是一種具有多巴胺能特性的神經(jīng)瘤細(xì)胞，常用于研究PD的發(fā)病機(jī)制[8]。MPP+可通過降低細(xì)胞膜電位、損傷線粒體呼吸鏈，增加ROS含量，從而引起氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[9]。在本研究中，我們采用600 μmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。近年來許多研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)在PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡中起著主要作用，因此抗氧化已成為治療PD的重要手段[10]。多項(xiàng)研究證實(shí)，ZER可通過激活Nrf2/HO-1通路抑制ROS生成，減輕多種病理因素所造成的氧化應(yīng)激損傷[4-6],但其對神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用目前尚無相關(guān)報道。在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，ZER可劑量依賴性地減輕MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。

正常大腦黑質(zhì)特別容易受到氧化應(yīng)激損傷，這主要與多巴胺的氧化代謝過程有關(guān)。多巴胺在單胺氧化酶B催化的氧化脫胺反應(yīng)以及自身氧化生成神經(jīng)黑色素的過程中都會能產(chǎn)生過氧化氫[11]。由于神經(jīng)黑色素對Fe3+具有高親和力致使黑質(zhì)中聚集高濃度的Fe3+，當(dāng)Fe3+被還原成Fe2+后，F(xiàn)e2+可與過氧化氫通過Fenton反應(yīng)生成具有高度細(xì)胞毒作用的羥自由基，羥自由基可造成蛋白質(zhì)、核酸和含有大量未飽和脂肪酸的細(xì)胞膜的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，ZER可抑制MPP+引起的ROS生成和細(xì)胞凋亡，而抗氧化劑NAC具有相似的作用。

PARK7又名DJ-1，是PD的致病基因。PARK7基因突變首先由Bonifati等[13]在荷蘭和意大利早發(fā)PD家系中發(fā)現(xiàn)。正常情況下PARK7蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，少部分存在于細(xì)胞核與線粒體中。定位于線粒體的PARK7蛋白可通過保持線粒體復(fù)合物I的活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，敲除PARK7基因可加重脂多糖對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷[15]。此外，在氧化應(yīng)激刺激下，PARK7蛋白可通過氧化自身的Cys106清除過氧化氫[16]，而被氧化的PARK7蛋白還可結(jié)合p53并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，以阻止細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果表明，MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中PARK7蛋白表達(dá)水平顯著降低，而ZER可劑量依賴性地上調(diào)模型細(xì)胞中PARK7蛋白的表達(dá)水平。

Clements等[18]研究證實(shí)，PARK7能穩(wěn)定對抗氧化相關(guān)基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的Nrf2。生理狀態(tài)下與胞質(zhì)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keleh-like ECH-associated protein 1，Keap1)結(jié)合，處于抑制狀態(tài)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1分離，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element，ARE)結(jié)合，啟動ARE調(diào)控的抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[19]。HO-1是受其調(diào)控的一個非常重要的抗氧化酶[20]。已有研究證實(shí)，沉默Nrf2基因可抑制SH-SY5Y細(xì)胞中HO-1的表達(dá)[21]。Youn等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在體外增加SH-SY5Y細(xì)胞中HO-1蛋白水平可抑制MPP+誘導(dǎo)的ROS生成和細(xì)胞毒作用，在體內(nèi)HO-1可減輕MPP+對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ZER可上調(diào)經(jīng)MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平。而沉默PARK7可抑制Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)，增加ROS含量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明PARK7可通過激活Nrf2/HO-1通路，抑制氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，ZER可在體外劑量依賴性地減輕MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，這可能與ZER激活PARK7/Nrf2/HO-1通路，繼而抑制MPP+誘導(dǎo)的ROS生成和細(xì)胞凋亡有關(guān)，具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。本研究為ZER治療帕金森病提供了基礎(chǔ)性資料，但還需臨床試驗(yàn)來檢驗(yàn)其有效性和安全性。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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