王照巖，楊玉玲，楊志一，尹崇高，李洪利，劉雨清△

(濰坊醫(yī)學院 1病理學教研室， 2醫(yī)學研究實驗中心， 3護理學院， 山東 濰坊 261053)

乳腺癌是全球女性腫瘤相關死亡的主要疾病，每年有超過150萬的新確診病例[1]。盡管通過手術、放療和化療的聯(lián)合應用，已大大提高了早期乳腺癌患者的生存率，但晚期患者的臨床生存率仍不容樂觀[2]。因此，研究乳腺癌遠處轉移的分子機制，為提高病人的生存率提供新的理論依據(jù)。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種非編碼單鏈RNA分子，大約由22個核苷酸組成，可通過對靶基因的mRNA進行特異性堿基配對，調控靶基因的翻譯過程，從而調節(jié)轉錄后基因表達[3]。上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞獲得間充質特征的一種現(xiàn)象，通過EMT，具有間質特征的腫瘤細胞明顯增強了侵襲與遷移能力。新的研究表明，EMT在腫瘤細胞遷移的早期過程起著關鍵作用，并可通過多種信號通路促進癌細胞的侵襲轉移[4]。miRNA在EMT中扮演著重要的角色，如miR-655[5]和miR-208[6]通過誘導EMT的發(fā)生促進腫瘤細胞的侵襲轉移。生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)相關結合蛋白2(GRB2-associated-binding protein 2，GAB2)是DOS/GAB家族的成員，通過整合多種信號通路，參與多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠通過調控GAB2抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉移[7]。但miR-125a-5p能否通過其它機制對乳腺癌細胞EMT影響的研究尚不清楚。因此，本研究進一步探討miR-125a-5p通過糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/Snail信號通路對乳腺癌細胞EMT的作用，為抑制乳腺癌細胞發(fā)生遠處轉移提供有價值的miRNA分子，同時也為乳腺癌治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 主要材料

抗波形蛋白(vimentin)和上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin)單克隆抗體購自Santa Cruz；抗Snail、p-GSK-3β和GSK-3β抗體購自Cell Signaling Technology；表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)購自Peprotech；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑購自Invitrogen；Transwell小室購自 Corning；Matrigel購自BD；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A細胞購自ATCC。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)參照先前文獻[8]。按文獻[9]將細胞分組：(1)MDA-MB-231/NC組，轉入空載質粒；(2)MDA-MB-231/miR-125a-5p組，轉入miR-125a-5p過表達質粒；(3)MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組，同時轉入miR-125a-5p過表達質粒和GAB2過表達對照質粒；(4)MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組，同時轉入miR-125a-5p過表達質粒和GAB2過表達質粒。

2.2RT-qPCR實驗 RNA提取及逆轉錄過程參照先前文獻[10]。 PCR條件為95 ℃ 5 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進行35個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，U6的上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3′。miR-125a-5p的上游引物為5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，莖環(huán)結構序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG-3′。

2.3趨化運動實驗 用EGF按4種不同濃度(0、1、10和100 μg/L)分別刺激MDA-MB-231細胞24 h，Transwell上室中加入細胞懸液，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，固定、洗滌、Giemsa染色并拍照計數(shù)，所有實驗均重復3次。

2.4Transwell侵襲實驗 實驗過程參照先前文獻[11]。隨機選取5個高倍鏡視野拍照計數(shù)，計算平均值為實驗的最終結果，所有實驗均重復3次。

2.5核質分離 按核質分離試劑盒說明書對培養(yǎng)24 h后的各組細胞進行提取核蛋白，將所得的蛋白應用Western blot檢測Snail蛋白在各組細胞中的表達。實驗重復3次。

2.6Western blot實驗 將轉染后的細胞抽提蛋白。上樣，電泳，轉膜，封閉，滴加 I 抗4 ℃過夜，滴加 II 抗，TBST洗膜，曝光?？贵w配制如下：β-actin(1∶1 000)、Snail(1∶500)、p-GSK-3β(1∶500)、GSK-3β(1∶500)、nucleolin(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、vimentin(1∶500)。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD)，兩組間定量資料采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-125a-5p在人正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達情況

RT-qPCR檢測結果顯示，與人正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7中的miR-125a-5p表達明顯降低(P<0.05)。結果表明，miR-125a-5p在MDA-MB-231和MCF-7細胞中低表達，見圖1。

Figure 1. The expression of miR-125a-5p in normal breast epithelial cells and breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMCF-10A group.

圖1miR-125a-5p在人正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達情況

2 miR-125a-5p在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的轉染效率

RT-qPCR檢測結果顯示，與MDA-MB-231/NC組細胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細胞中miR-125a-5p的水平明顯增高(P<0.05)，提示轉染成功，見圖2。

Figure 2. The transfection efficiency of miR-125a-5p in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC group.

圖2miR-125a-5p在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的轉染效率

3 EGF刺激乳腺癌細胞MDA-MB-231的最適濃度為10 μg/L

趨化運動實驗結果顯示，用0、1、10和100 μg/L的4種濃度的EGF刺激MDA-MB-231細胞后，與未用EGF刺激的MDA-MB-231細胞相比，其它3種濃度刺激的MDA-MB-231細胞趨化能力明顯增強，其中，EGF濃度為10 μg/L時刺激趨化能力最強(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The optimal stimulation concentration of EGF in MDA-MB-231 cells was at 10 μg/L. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖3EGF刺激乳腺癌細胞MDA-MB-231的最適濃度為10μg/L

4 miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的侵襲能力

Transwell侵襲實驗結果顯示，用EGF刺激24 h后，與MDA-MB-231/NC組細胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細胞穿過基底膜的細胞數(shù)明顯減少；而MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細胞穿過基底膜的細胞數(shù)比MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組細胞明顯增多(P<0.05)，表明miR-125a-5p能明顯降低MDA-MB-231細胞的侵襲能力，見圖4。

5 miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的上皮-間質轉化

Western blot檢測EMT相關標志物的表達情況。結果顯示，用EGF刺激后，在MDA-MB-231/miR-125a-5p組中，E-cadherin的表達量比MDA-MB-231/NC組細胞中的表達量明顯上調，而vimentin的表達量顯著下調(P<0.05)；與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細胞中E-cadherin的表達量顯著下調，vimentin的表達量明顯上調(P<0.05)，表明miR-125a-5p可有效抑制MDA-MB-231細胞的EMT，見圖5。

6 miR-125a-5p對GSK-3β/Snail信號通路的影響

用10 μg/L EGF刺激乳腺癌細胞MDA-MB-231，Western blot檢測結果顯示，與MDA-MB-231/NC組細胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細胞中的p-GSK-3β和Snail蛋白水平明顯下調(P<0.05)；而MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細胞中的p-GSK-3β和Snail蛋白水平與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組細胞相比明顯上調(P<0.05)，表明miR-125a-5p通過GSK-3β/Snail信號通路，抑制MDA-MB-231細胞中Snail的入核，見圖6、7。

Figure 4. miR-125a-5p inhibited the invasion ability of breast cancer cells (Giemsa staining, scale bar=100 μm). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC;△P<0.05vsMDA-MB-231/mir-125a-5p+Con.

圖4miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的侵襲能力

Figure 5. miR-125a-5p inhibited epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖5miR-125a-5p抑制乳腺癌細胞的上皮-間充質轉化

討 論

乳腺癌是由多種復雜病因引起的異質性疾病，涉及到基因和環(huán)境因素，已對女性的生命和健康構成嚴重威脅[12]。遠處轉移是引起死亡率劇增的主要原因，其分子機制一直是腫瘤研究領域的熱點。因此，研究乳腺癌細胞發(fā)生侵襲轉移的潛在分子機制是治療乳腺癌的重點與難點。

miRNA通過對下游靶基因進行靶向調控，間接發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[13]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA的失調在腫瘤惡性轉化和進展中起著至關重要的作用[14]。

Figure 6. The phosphorylation of GSK-3β in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖6GSK-3β在MDA-MB-231細胞中的磷酸化水平

Figure 7. The expression levels of Snail protein in the nucleus of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖7Snail蛋白在MDA-MB-231細胞核中的表達水平

其中，miR-125是一個重要的miRNAs家族，其成員已被證實參與多種腫瘤類型，如肝癌[15]等。先前研究表明，miR-125a-5p可靶向調控BCL2、BCL2L12和MCL1，抑制結腸癌細胞的增殖[16]。同時miR-125a-5p 可負性調節(jié)GAB2的表達，抑制膠質瘤細胞的侵襲轉移[9]。本研究中，將 miR-125a-5p質粒轉染MDA-MB-231細胞，實現(xiàn)了miR-125a-5p的過表達，降低了MDA-MB-231細胞的體外侵襲能力；而在MDA-MB-231細胞中，與轉染miR-125a-5p+Con質粒的細胞組相比，轉染miR-125a-5p+GAB2質粒的細胞組體外侵襲能力明顯增強。

新近研究表明，EMT的發(fā)生在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中非常復雜，多條信號通路參與調控EMT過程，如Notch[17]、NF-κB[18]、ERK[19]和GSK-3β/Snail信號通路[20]等。其中，GSK-3β/Snail信號通路在EMT過程中至關重要。GSK-3β在許多參與EMT過程的信號通路中具有分子開關的功能，并參與調節(jié)多種生物功能，如細胞增殖[21]、分化[22]和遷移[23]等。Snail是EMT的一種重要的誘導物，是E-cadherin的關鍵轉錄調控器[24]。Zhou等[25]發(fā)現(xiàn)CXCR2/CXCL5可通過激活GSK-3β/Snail信號通路促進肝癌細胞的EMT發(fā)生。本研究中，與MDA-MB-231/NC細胞組相比，在MDA-MB-231/miR-125a-5p細胞組中GSK-3β的磷酸化水平和Snail轉核明顯降低，并引起E-cadherin表達上調，vimentin表達下調；與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con細胞組相比，在MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2細胞組中GSK-3β的磷酸化水平和Snail轉核明顯增加，E-cadherin表達下調，vimentin表達上調。

綜上所述，miR-125a-5p可通過GSK-3β/Snail信號通路抑制乳腺癌細胞EMT的發(fā)生，進而抑制乳腺癌的侵襲與轉移。因此，miR-125a-5p有望成為乳腺癌的獨立預測因子，在乳腺癌的治療和預后方面帶來新的應用。

[參 考 文 獻]

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