郭艷琳，呂 豆，封啟龍，王曉暉，張華屏，楊彩紅，鄭文亮，康玉明

(山西醫(yī)科大學(xué) 1病理學(xué)教研室， 2生理學(xué)系， 3轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 4藥理學(xué)教研室， 山西 太原 030001； 5西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)教研室， 陜西 西安 710061)

交感神經(jīng)興奮性增強是慢性心力衰竭(heart fai-lure，HF; 簡稱心衰)重要的病理特征之一，并且與心衰患者的發(fā)病率和死亡率顯著相關(guān)。許多研究表明，心衰時外周及中樞內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)被激活，腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素6等促炎細胞因子升高，并參與增強交感神經(jīng)興奮性[1-3]。RAS和促炎細胞因子分子量均較大，不易通過血腦屏障；而且中樞內(nèi)RAS和促炎細胞因子等成分的受體分布范圍和產(chǎn)生效應(yīng)的部位并不完全一致[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)心衰時腦內(nèi)產(chǎn)生的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可能是介導(dǎo)RAS和促炎細胞因子中樞效應(yīng)的關(guān)鍵分子之一[6-7]。PGE2是一種炎癥介質(zhì)，在誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的作用下由花生四稀酸大量合成。以往急性實驗發(fā)現(xiàn)，向正常大鼠側(cè)腦室或直接向下丘腦室旁核(periventricular nucleus，PVN)注射PGE2可導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增強[7-8]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)心衰模型中，COX-2抑制劑灌胃給藥可以減輕心衰時交感神經(jīng)的興奮性，改善心功能[9]。本研究采用左室冠脈結(jié)扎制備大鼠心衰模型，側(cè)腦室中樞給予COX-2抑制劑塞來考昔(celecoxib,CLB)深入研究了中樞PGE2在心衰病理過程中的作用。

另外，在免疫和應(yīng)激狀態(tài)下，中樞內(nèi)PGE2升高，可激活PVN內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)神經(jīng)元，使垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)分泌增加，外周血皮質(zhì)酮(大鼠)和皮質(zhì)醇(人類)增加[10]。我們前期的研究表明，心衰時下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元被激活并可增強外周交感神經(jīng)活動，加重心功能惡化[11]。本研究進一步觀察了心衰時中樞內(nèi)PGE2是否可以激活CRH神經(jīng)元引發(fā)交感神經(jīng)活動增強，并探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物分組及模型制備

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上進行側(cè)腦室插管(位置：前囟1.0 mm，中線1.5 mm，垂直3.5 mm)。恢復(fù)2周后，結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備心衰模型，假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎。術(shù)中監(jiān)測標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，出現(xiàn)ST段和/或T波抬高或降低，心臟局部顏色變白和室壁運動減弱等變化作為結(jié)扎成功的標志。并于頸背部埋置已充滿藥液的微型滲透泵(Alzet Model #2004，DURECT)，而后連接至側(cè)腦室插管。動物分3組，假手術(shù)組(sham組)和心衰模型組(HF組)給溶劑對照人工腦脊液(0.25 μL/h);造模成功后給COX-2抑制劑CLB (15 mg/h)為心衰模型給藥組(HF+CLB組)，給藥4周。

2 實驗方法

2.1血流動力學(xué)測定和交感神經(jīng)電活動記錄 各組大鼠用烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉，暴露右側(cè)頸總動脈，插入直徑約1 mm的抗凝硬塑管至主動脈，硬塑管另一端連接P-50壓力換能器，壓力信號輸入成都儀器廠生物機能實驗系統(tǒng)(BL-RM6240)導(dǎo)管進一步深入到左心室記錄左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(maximal rise rate of left ventricular pressure，+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(maximal decline rate of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。之后，手術(shù)暴露腎臟，游離腎交感神經(jīng)并將其搭在雙極金屬電極上，記錄電活動。首先記錄腎交感神經(jīng)在安靜狀態(tài)下的放電情況，在曲線運行區(qū)間，通過靜脈注射硝普鈉(100 μg/kg)[4]誘發(fā)腎交感神經(jīng)放電的最高峰值。將基礎(chǔ)放電電壓與硝普鈉誘發(fā)的最高放電值之比作為統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，對各組間腎交感神經(jīng)活動(renal sympathetic nerve activity，RSNA)情況進行比較。

2.2解剖學(xué)測量 血流動力學(xué)測定及腎交感神經(jīng)電活動記錄結(jié)束后取心臟和肺，計算肺/體質(zhì)量比(lung-to-body weight ratio，Lung/BW)和右心室/體質(zhì)量比(right ventricular-to-body weight ratio，RV/BW)作為肺淤血和心室重構(gòu)的指標。這2個指標通常被認為是左心衰嚴重程度指數(shù)。

2.3腦脊液采集[12]大鼠麻醉后俯臥位置于動物固定架上，暴露枕骨大孔。用預(yù)先自制的針尖稍微彎曲約130°的1 mL注射器輕輕刺穿腦膜，而后保持與動物頭部彎曲角度平行進針抽取腦脊液。

2.4酶聯(lián)免疫吸附實驗 取各實驗組大鼠血漿，檢測ACTH和去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)含量；取上述采集的腦脊液檢測PGE2含量。實驗步驟嚴格按照ELISA試劑盒(Bio-Rad)說明進行，結(jié)果用酶標儀讀取。吸光度(A)值經(jīng)轉(zhuǎn)換后計算各組分實際含量。

2.5免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟灌流(生理鹽水和2%多聚甲醛)術(shù)后取完整腦組織置于2%多聚甲醛中固定5 h，然后轉(zhuǎn)移至0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的30%蔗糖溶液中浸泡2～3 d。固定好的腦組織用OCT混合物包埋，迅速冷凍后進行冰凍切片(厚度14 μm)。免疫組化染色采用高靈敏度的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，S-P)法。 I 抗稀釋比例：兔抗CRH為 1∶80，兔抗谷氨酸脫羧酶76(glutamate decarboxylase 76，GAD67)為1∶80，均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。每張切片核團部位選取5個高倍視野(×400)，對陽性神經(jīng)元計數(shù)，取其均值(個/視野)作為結(jié)果。

2.6高效液相色譜(HPLC)檢測下丘腦室旁核神經(jīng)遞質(zhì)含量[13]樣品制備：微切割大鼠單側(cè)下丘腦室旁核，加入150 μL 0.1 mol/L HClO4,超聲粉碎制備組織勻漿，10 000 r/min 離心，提取上清液留存于-80 ℃冰箱，以備進行HPLC檢測。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和谷氨酸(glutamic acid，Glu)的測定：分別稱取14.17 mg Glu和10.32 mg GABA以生理鹽水定容至100 mL，為 1 mmol /L的標準品儲備液。氨基酸衍生試劑：13.5 mg鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)、10 μL β-巰基乙醇加入2.5 mL 0.1 mol/L K2CO3緩沖液(pH 9.5)和10%甲醇配制成40 mmol/L OPA母液，儲存于4 ℃冰箱內(nèi)。臨用前用0.1 mol/L K2CO3緩沖液(pH 9.5)稀釋成4 mmol/L的OPA工作液。標準品與樣品預(yù)處理和衍生：吸取12 μL樣品和3 μL 4 mmol/L OPA混合，在25 ℃條件下衍生3 min。吸取10 μL進色譜儀進行分析。色譜條件：色譜柱Eicompak SC-5ODS 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：30%甲醇：70% 0.1 mol/L PBS(含0.5 mmol/L EDTA pH 6.5)；流速為1.0 mL/min、檢測波長為360 nm、電壓為+700 mV。信號記錄和分析軟件為ES280 PowerChrom software (eDAQ)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠死亡情況

HF組大鼠死亡率為39%(18/46)，心衰模型大鼠給予COX-2抑制劑塞來考昔后，大鼠的死亡率為28%(10/36)，較模型組降低。經(jīng)卡方檢驗，2組差異存在統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。

2 腦脊液內(nèi)PGE2含量的變化

與sham組相比，HF組大鼠腦脊液內(nèi)的PGE2含量升高(P<0.05)；與HF組相比，給予CLB治療后，HF+CLB組大鼠PGE2含量明顯降低(P<0.05)，基本接近sham組，見圖1。

Figure 1. Th changes of the PGE2levels in cerebrospinal fluid in rats of each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

圖1各組大鼠腦脊液內(nèi)PGE2含量的變化

3 心功能指標的變化

與sham組相比，HF組RV/BW、Lung/BW和LVEDP顯著增加， ±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；與HF組相比，HF+CLB組RV/BW、Lung/BW和LVEDP比值降低(P<0.05), ±dp/dtmax增高(P<0.05)，見表1。

4 交感神經(jīng)興奮性指標的變化

與sham組相比，HF組RSNA明顯增強，血漿NE含量升高(P<0.05)；與HF組相比，HF+CLB組RSNA減弱，NE含量降低(P<0.05)，見圖2。

5 下丘腦室旁核內(nèi)CRH神經(jīng)元激活指標的變化

下丘腦室旁核內(nèi)CRH免疫反應(yīng)陽性染色呈棕黃色或棕褐色，主要定位于室旁核內(nèi)側(cè)小細胞神經(jīng)元胞漿內(nèi)。與sham組相比，HF組中CRH陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著增多，血漿ACTH含量升高(P<0.05)；與HF組相比，HF+CLB組CRH陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，ACTH含量明顯降低(P<0.05)，見圖3。

表1 各組大鼠心功能指標的檢測結(jié)果Table 1. The results of cardiac function indicators (Mean±SD. n=6)

*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

Figure 2. The changes of the sympathetic activity in rats of each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

圖2各組大鼠交感神經(jīng)興奮性指標的變化

Figure 3. The changes of CRH neuron activation in the hypothalamic paraventricular nucleus in rats of each group (DAB staining，×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

圖3各組大鼠下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元激活指標的變化

6 下丘腦室旁核谷氨酸脫羧酶67表達的變化

下丘腦室旁核區(qū)域GAD67免疫反應(yīng)陽性染色呈棕黃色或棕褐色，主要定位于下丘腦室旁核背側(cè)和外側(cè)邊界附近，以及圍繞被蓋外側(cè)邊界等區(qū)域的神經(jīng)元胞漿內(nèi)。與sham組相比，HF組GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與HF組相比，HF+CLB組GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05)，見圖4。

7 下丘腦室旁核區(qū)域神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的變化

與sham組相比，下丘腦室旁核區(qū)GABA含量明顯減少，Glu含量顯著增多(P<0.05)；與HF組相比，HF+CLB組Glu含量減少，GABA增加(P<0.05)，見表2。

Figure 4. GAD67 expression in and around hypothalamic paraventricular nucleus in rats of each group (DAB staining， ×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

圖4各組大鼠下丘腦室旁核內(nèi)及周邊GAD67表達的變化

表2 各組大鼠下丘腦室旁核內(nèi)GABA和Glu 含量的變化Table 2. Levels of GABA and Glu in the PVN (Mean±SD. n=6)

*P<0.05vssham group;?P<0.05vsHF group.

討 論

1 慢性心衰時中樞內(nèi)PG E2可激活下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元參與交感神經(jīng)活動增強

塞來考昔是一種選擇性COX-2抑制劑。外周給予COX-2抑制劑對心血管系統(tǒng)作用的研究結(jié)果存在很大分歧。大多數(shù)研究表明，COX-2抑制劑破壞了血管內(nèi)皮在血栓形成過程中促栓/抗栓的平衡，傾向于血栓形成；促進鈉水潴留，導(dǎo)致水腫，加重心力衰竭和高血壓；抑制了COX-2上調(diào)在缺血性心臟病和心肌梗死中增加血流量的保護作用，進而導(dǎo)致梗死面積增大，梗死區(qū)的室壁變薄，易發(fā)生心臟破裂[14]。有文獻指出[15]，有心肌梗死病史的患者使用塞來考昔，再次發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險增加。然而，有一些研究[9,16]發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑有可能通過減輕心肌損傷后的炎癥反應(yīng)和心室重構(gòu)，進而改善心功能。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在所有引起慢性充血性心力衰竭病因中，冠心病已逐漸成為最主要的病因，約占36%[17]。本研究采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備心衰模型，能較好地模擬臨床冠心病-心肌梗死-心力衰竭這一病理過程，更具有實際意義[18]；側(cè)腦室滲透壓泵給予COX-2抑制劑，不但更適合慢性疾病過程的研究，而且能排除外周給藥研究中樞機制的局限性。結(jié)果顯示，與正常對照相比，心衰大鼠腦脊液內(nèi)PGE2含量增加，腎交感神經(jīng)活動增強，外周血去甲腎上腺素升高；心功能惡化：LVEDP、RV/BW和Lung/BW均增加；±dp/dtmax明顯降低。側(cè)腦室慢性給予COX-2抑制劑塞來考昔后，腦脊液內(nèi)PGE2明顯下降，以上各種心衰癥狀也明顯逆轉(zhuǎn)，表明慢性心衰時中樞內(nèi)升高的PGE2參與交感神經(jīng)興奮性增強和心功能的惡化。

有研究將PGE2注入正常大鼠側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)下丘腦室旁核內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素神經(jīng)元免疫活性和RNA合成增加，交感神經(jīng)興奮性增強[19]；由PGE2引發(fā)的交感神經(jīng)活動增強可以被CRH拮抗劑阻斷[8]。我們前期的研究結(jié)果表明，心衰時PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元被激活，外周血ACTH升高，同時伴有腎交感神經(jīng)興奮性增強和外周血NE升高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，心衰大鼠側(cè)腦室慢性給予CLB后，不但腦脊液PGE2含量明顯下降，而且PVN內(nèi)CRH陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，外周血ACTH水平下降，同時RSNA明顯減弱，外周血NE降低。以上結(jié)果提示，心衰時中樞內(nèi)升高的PGE2可能通過激活下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元引發(fā)交感神經(jīng)活動增強，進而加重心功能不全的發(fā)展。

2 在慢性心衰過程中，中樞內(nèi)升高的PGE2可能通過改變PVN區(qū)域神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)激活CRH神經(jīng)元，導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增強

PGE2有4種受體亞型，即EP1、EP2、EP3和EP4，它們所處的位置決定了PGE2與之結(jié)合后的效應(yīng)。EP3受體亞型是嚙齒類動物主要的受體形式，主要分布于腦干向PVN投射的兒茶酚胺能神經(jīng)元，下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)也有表達，但并未在PVN中發(fā)現(xiàn)[20-21]。Yu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，心衰時PVN內(nèi)微循環(huán)的血管周細胞COX-2的表達增強，并明顯增加PVN內(nèi)總COX-2蛋白含量；然而，正常情況下皮質(zhì)區(qū)高組成性表達COX-2，心衰時并沒有增加，表明心衰時中樞內(nèi)激活的COX-2主要在PVN水平發(fā)揮作用。那么，心衰時PGE2在PVN區(qū)如何激活CRH神經(jīng)元，參與交感神經(jīng)興奮性增強，成為一個值得探討的問題。

PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元的緊張性激活由多種興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)來調(diào)節(jié)，包括谷氨酸、去甲腎上腺素和GABA等。另外，PVN內(nèi)存在谷氨酸能中間神經(jīng)元，PVN內(nèi)及周邊部存在GABA能中間神經(jīng)元，它們均與CRH神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系[23]。心衰時，PVN內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡是引發(fā)交感神經(jīng)興奮性增強的重要原因[13]。GABA是PVN內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體在PVN神經(jīng)元廣泛分布[24]。生理狀態(tài)下，PVN內(nèi)交感神經(jīng)的緊張性輸出主要由GABA能傳入調(diào)控[25]；心衰時GABA能介導(dǎo)的交感神經(jīng)抑制作用降低，參與了交感神經(jīng)興奮性增強[26]。谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交感輸出發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。正常情況下，PVN的谷氨酸能傳入在基礎(chǔ)性交感輸出中不發(fā)揮重要作用[27]，但在病理條件下，如高血壓等，對維持高水平的交感緊張性是不可或缺的[28]。

谷氨酸脫羧酶是在胞漿內(nèi)催化Glu生成GABA的限速酶，直接影響二者在腦組織中的濃度。GAD在腦組織中分布與GABA能神經(jīng)元基本一致，并且在腦組織中比GABA更穩(wěn)定，被認為是GABA能神經(jīng)元的特異性標志物[29]。GAD有GAD65和GAD67 2種亞型，GAD65常常作為GABA能神經(jīng)元活性增強階段的補充，而GAD67在GABA 能神經(jīng)元的緊張性活動中起重要作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)GABA能神經(jīng)元主要分布于PVN核團背側(cè)和外側(cè)邊界附近，以及圍繞被蓋外側(cè)邊界區(qū)[31]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心衰大鼠PVN內(nèi)及其周邊GAD67陽性神經(jīng)元明顯減少，GABA顯著下降，而Glu顯著增加，同時腎交感神經(jīng)興奮性增強，外周血NE濃度升高；側(cè)腦室慢性給予CLB后，PVN區(qū)GAD67陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，GABA上升，Glu下降，腎交感神經(jīng)活動和外周血NE也明顯下降。以上結(jié)果表明，心衰時中樞內(nèi)PGE2升高，引發(fā)了PVN內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu的失衡，而后者在心衰時交感神經(jīng)興奮性增強過程中發(fā)揮了重要作用。

對本部分實驗結(jié)果分析時值得注意的是，側(cè)腦室慢性給予CLB后僅僅引起給藥組GAD67的部分阻斷，而對神經(jīng)遞質(zhì)GABA和Glu的影響更為明顯，二者基本接近假手術(shù)組水平。對于這樣的結(jié)果，我們認為可能的原因有：(1)PVN內(nèi)GABA和Glu的含量，不僅和它們本身的合成分解有關(guān)，還受對突觸傳遞過程具有調(diào)節(jié)作用的多種因素影響。一氧化氮(nitric oxide，NO)是重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可以通過NO-cGMP-PKG通路促進突觸囊泡的錨定和膜融合，調(diào)節(jié)包括GABA[32]和Glu[33]等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。我們的研究發(fā)現(xiàn)，心衰時腦內(nèi)產(chǎn)生的PGE2可以抑制PVN內(nèi)nNOS神經(jīng)元的活性，導(dǎo)致內(nèi)源性NO產(chǎn)生減少(本文未呈現(xiàn))；(2)中樞PGE2除了對局部GABA和Glu的直接影響外，也有可能通過間接途徑(如多級神經(jīng)支配)調(diào)節(jié)進入PVN及周邊區(qū)GABA能和谷氨酸能傳入。因此，給藥途徑更為精準的深入研究有待進行。

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