徐 潔，楊 羚，張 萌，朱敏航，謝 芬，金曉霞，袁 瓊，周乾毅

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院新藥創(chuàng)制研究所， 職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430065)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其它心臟病變來解釋的特異性心肌病[1]。然而，現(xiàn)有的藥物治療DCM的效果不佳。西格列汀(sitagliptin，SLT)是二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)的抑制劑，它能通過抑制DPP-IV降解胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的作用從而促進(jìn)了胰島素的釋放，進(jìn)而發(fā)揮降血糖的作用[2]?，F(xiàn)有研究已證實(shí)西格列汀能抑制實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)引起的心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥大和纖維化[3-6]。然而，西格列汀是否具有治療DCM的作用及其機(jī)制還有待研究。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是新近被認(rèn)識(shí)的一種caspase-1依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式，這種程序性死亡方式伴隨著caspase-1表達(dá)上調(diào)及炎癥因子白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的激活與釋放并產(chǎn)生炎癥小體[7-9]。近期研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞焦亡參與心臟疾病進(jìn)展，提示調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡可能是緩解和改善心血管疾病中的治療方向。多項(xiàng)研究已證實(shí)NLRP3炎癥小體參與心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生并能促進(jìn)DCM的發(fā)生與發(fā)展[10-11]；另一方面，新近研究證實(shí)，NLRP3基因沉默能抑制DCM的發(fā)生[12]，因此，NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能是DCM藥物治療的靶點(diǎn)之一。

SIRT3是高度保守的尼克酰胺依賴性Ⅲ組蛋白去乙?；竤irtuins蛋白家族成員，定位于線粒體，主要功能是催化線粒體應(yīng)激反應(yīng)蛋白去乙?；痆13]。大量研究已經(jīng)確證線粒體在細(xì)胞焦亡的炎癥小體激活中起著中心調(diào)節(jié)作用[14-15]; SIRT3的活化能保護(hù)心肌細(xì)胞及避免心肌病的發(fā)生[16-20]。基于這些研究，我們推測SIRT3能通過調(diào)控線粒體功能抑制NLRP3炎癥小體,從而抑制糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。

本實(shí)驗(yàn)研究擬利用高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，研究西格列汀對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞焦亡的影響，并采用sirtuin家族抑制劑尼克酰胺(nicotinamide，NAM)探討此影響機(jī)制是否涉及SIRT3/NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，為尋找新型治療糖尿病心肌病的藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及試劑

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重200～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(No. 42000600009018)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫(24±3) ℃，通風(fēng)良好，自由攝食飲水。鏈脲佐菌素購于Sigma；尼克酰胺購于江蘇碧云天生物公司；西格列汀購于Merck；血糖測定試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司；抗SIRT3和β-actin抗體購于Santa Cruz Biotechnology；抗IL-β和caspase-1抗體購于武漢三鷹公司。

2 方法

2.12型糖尿病大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 11周的SD雄性大鼠，體重200～220 g，高糖高脂飼料(含66.5%常規(guī)飼料、20% 蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇和1.0%膽酸鹽)喂養(yǎng)8周后一次性腹腔注射STZ (用0.1 mol/L、pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)35 mg/kg，1周后尾靜脈采血測血糖，模型成功標(biāo)準(zhǔn)參考1999年WHO對(duì)2型糖尿病大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)，將隨機(jī)血糖大于11.1 mmol/L定為造模成功。隨機(jī)選取正常大鼠16只和成模大鼠40只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，正常大鼠分為2個(gè)亞組：正常對(duì)照(control)組(n=8)和NAM (500 mg/kg)組(n=8)；成模大鼠隨機(jī)分為5組：模型組(T2DM組，n=8)、西格列汀低劑量[SLT(L)，3 mg/kg，n=8]組、西格列汀中劑量[SLT(M)，10 mg/kg，n=8]組、西格列汀高劑量[SLT(H)，30 mg/kg，n=8]組及西格列汀(30 mg/kg)+NAM(500 mg/kg)聯(lián)合用藥[SLT(H)+NAM]組(n=8)。正常對(duì)照組和T2DM組給予等量生理鹽水灌胃。所有大鼠均連續(xù)灌胃4周，干預(yù)期間正常大鼠繼續(xù)喂食普通飼料，成模組大鼠繼續(xù)喂食高糖高脂飼料，自由進(jìn)水。

2.2標(biāo)本的收集及檢測 連續(xù)灌胃4周后所有大鼠禁食不禁水過夜，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈取血，靜止15 min后離心，血糖儀紙片法測定血糖，同時(shí)分別取大鼠心臟組織檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA裂解液裂解心肌組織并提取總蛋白，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，4 ℃封閉后孵育相應(yīng)目的蛋白的抗體[SIRT3(1∶2 000)、IL-β(1∶500)、caspase-1(1∶500)和β-actin(1∶2 000)]過夜。TBST洗膜3次后室溫孵育 II 抗[HRP標(biāo)記的抗兔(1∶1 000)和HRP標(biāo)記的抗鼠(1∶2 000)IgG]1 h，洗膜3次，ECL顯影。

2.4免疫組織化學(xué)染色 將心肌組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用SP法嚴(yán)格按照說明書操作檢測SIRT3(1∶50)、caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶100)及NLRP3(1∶200)蛋白表達(dá)。通過檸檬酸抗原熱修復(fù)， DAB顯色，PBS代替 I 抗作為陰性對(duì)照。顯色完畢后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明并用中性樹膠封片。每個(gè)切片隨機(jī)盲選5個(gè)視野分別拍照，借助Image-Pro Plus 7.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 西格列汀降低2型糖尿病大鼠的血糖水平

與正常對(duì)照組相比，T2DM組大鼠血糖水平顯著升高(P<0.01)；西格列汀能劑量依賴性地抑制T2DM大鼠血糖水平，且高劑量西格列汀(30 mg/kg)效果最好(P<0.05)；sirtuin蛋白家族非特異性抑制劑NAM(500 mg/kg)不能阻斷西格列汀(30 mg/kg)的降糖作用，見圖1。

Figure 1. The blood glucose of rats in all groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsT2DM group；#P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group.

圖1各組大鼠血糖水平比較

2 西格列汀抑制2型糖尿病大鼠心肌焦亡

檢測caspase-1和IL-1β表達(dá)水平以評(píng)價(jià)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組的caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；西格列汀能劑量依賴性地抑制caspase-1和IL-1β的激活表達(dá)，且高劑量西格列汀(30 mg/kg)抑制心肌細(xì)胞焦亡的效果最好(P<0.01)；NAM(500 mg/kg)能逆轉(zhuǎn)西格列汀(30 mg/kg)抑制糖尿病心肌細(xì)胞caspase-1和IL-1β表達(dá)的作用(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)給予NAM(500 mg/kg)能增加正常大鼠心肌細(xì)胞caspase-1和IL-1β的表達(dá)(P<0.05)，見圖2。

3 西格列汀抑制NLRP3的表達(dá)

通過免疫組化和Western blot檢測心臟組織中NLRP3的表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，T2DM組大鼠心臟組織中NLRP3水平顯著升高(P<0.01)；西格列汀治療4周后，糖尿病大鼠心臟NLRP3的表達(dá)下調(diào)且呈劑量依賴性，西格列汀(30 mg/kg)抑制NLRP3表達(dá)的效果最好；而NAM能明顯逆轉(zhuǎn)西格列汀對(duì)NLRP3的抑制作用(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比，NAM(500 mg/kg)單獨(dú)用藥能上調(diào)正常大鼠NLRP3的表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

4 西格列汀上調(diào)心肌組織SIRT3表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，T2DM組大鼠心臟組織內(nèi)的SIRT3表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)；西格列汀呈劑量依賴性上調(diào)大鼠心臟的SIRT3表達(dá)，且西格列汀(30 mg/kg)作用最強(qiáng)(P<0.05)；NAM(500 mg/kg)干預(yù)作用對(duì)大鼠心臟組織內(nèi)SIRT3 的表達(dá)無明顯作用。該結(jié)果提示西格列汀能上調(diào)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞SIRT3表達(dá)(P<0.05)，見圖4。

討 論

糖尿病心肌病是由于心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起的廣泛的結(jié)構(gòu)異常最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)。細(xì)胞焦亡是新近被認(rèn)識(shí)的一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式，其特征為依賴于caspase-1并伴有大量促炎癥因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法及Western blot法檢測caspase-1和IL-1β表達(dá)來評(píng)價(jià)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，T2DM組的caspase-1和IL-1β表達(dá)水平均顯著升高，再次驗(yàn)證了在2型糖尿病大鼠模型中心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡的現(xiàn)象。

西格列汀是DPP-IV抑制劑，一種用于治療糖尿病的新型藥物。已有研究證實(shí)心肌細(xì)胞能表達(dá)DPP-IV。目前，對(duì)西格列汀治療糖尿病患者發(fā)生心衰的風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)不一。有研究人員認(rèn)為西格列汀能增加2型糖尿患者心衰危險(xiǎn)性[21]。也有研究者通過人群研究認(rèn)為，2型糖尿病患者使用西格列汀后能增加其1年內(nèi)心衰住院風(fēng)險(xiǎn)性，而之后卻能降低其心衰的風(fēng)險(xiǎn)[22]。由此可見西格列汀對(duì)糖尿病患者心功能的作用尚不能確定。而在本研究中，西格列汀能劑量依賴性地抑制糖尿病心肌病心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生。本研究提示西格列汀具有抑制糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用。然而，西格列汀對(duì)糖尿病心肌的保護(hù)作用是通過DPP-IV的直接作用還是通過GLP-1發(fā)揮作用還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

活化的NLRP3炎癥小體是一種基于NLRP3受體寡聚而形成的大分子復(fù)合物[17-18]。脂多糖和氧化型低密度脂蛋白能NF-κB依賴性地上調(diào)胞內(nèi)NLRP3蛋白和IL-1前體的表達(dá)[23-24]。NLRP3蛋白通過NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生自我寡聚, 借助PYD結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白ASC發(fā)生相互作用，進(jìn)而通過CARD結(jié)構(gòu)域招募胞內(nèi)的caspase-1前體，并使之發(fā)生剪切，釋放出具有水解酶活性的成熟caspase-1[15]?；罨腸aspase-1將剪切底物IL-1及IL-18前體轉(zhuǎn)變成具有促炎功能的成熟IL-1及IL-18, 并釋放至胞外。而由內(nèi)源性配體激活的NLRP3炎癥小體已發(fā)現(xiàn)參與多種疾病的發(fā)生，其中包括了代謝綜合征、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)和心臟再灌注損傷[25]。NLRP3炎癥小體被認(rèn)為與糖尿病誘導(dǎo)的多個(gè)臟器組織損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病能誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞NLRP3表達(dá)上調(diào)，而西格列汀能抑制NLRP3的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示西格列汀能通過抑制NLRP3依賴性的炎癥小體的形成抑制心肌細(xì)胞焦亡，保護(hù)心肌。

Figure 2. The effects of sitagliptin (SLT) on caspase-1 and IL-1β expression in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: caspase-1 expression detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for caspase-1 staining); B: caspase-1 detected by Western blot; C: IL-1β detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for IL-1β staining); D: IL-1β detected by Western blot. Mean±SD.n=8.+P<0.05，++P<0.01vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01vsT2DM group;△P<0.05vsSLT(L) group;▲P<0.05vsSLT(M) group;#P<0.05vsSLT(H) group.

圖2西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠心臟中casepase-1和IL-1β表達(dá)量的影響

SIRT3是高度保守的煙酰胺依賴性Ⅲ組蛋白去乙酰化酶sirtuins蛋白家族成員，定位于線粒體，其主要功能是催化線粒體應(yīng)激反應(yīng)蛋白去乙?；痆13]。在SIRT3缺陷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，SIRT3參與調(diào)節(jié)代謝、ATP生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種線粒體功能[26]。線粒體已經(jīng)被認(rèn)為在細(xì)胞焦亡的炎癥小體激活中起著中心調(diào)節(jié)作用，大量研究已經(jīng)確證不同的線粒體復(fù)合物靶向與炎癥小體的信號(hào)通路[20]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病能下調(diào)心臟SIRT3的表達(dá)，而給予西格列汀能劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)心肌中SIRT3蛋白表達(dá)。同時(shí)，我們也觀察到當(dāng)有NAM干預(yù)存在時(shí)能上調(diào)正常大鼠NLRP3表達(dá),促進(jìn)心肌細(xì)胞焦亡，能逆轉(zhuǎn)西格列汀對(duì)糖尿病大鼠心肌組織細(xì)胞下調(diào)NLRP3表達(dá)、抵抗心肌細(xì)胞焦亡的作用，但NAM并沒有影響到SIRT3蛋白表達(dá)，這可能是因?yàn)镹AM作為SIRT3的非特異性阻斷劑，其主要作用是抑制SIRT3蛋白的活性，而不是影響其表達(dá)。另一方面，NAM+SLT(H)組和SLT(H)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較顯示，SIRT3的表達(dá)沒有明顯變化，但焦亡增加了，我們推測西格列汀對(duì)糖尿病大鼠心肌組織焦亡的抑制作用有可能是通過促進(jìn)SIRT3表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)SIRT3活性被NAM阻斷時(shí)西格列汀對(duì)焦亡的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。當(dāng)然，NAM是否直接或是通過其它途徑發(fā)揮抑制作用還需要做進(jìn)一步探討。這些結(jié)果提示糖尿病時(shí)SIRT3的活性或表達(dá)減少，對(duì)NLRP3的表達(dá)抑制作用被解除，NLRP3含量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致DCM的發(fā)生。而西格列汀可以維持SIRT3的活性或表達(dá)，從而抑制這一過程。

Figure 3. The effect of sitagliptin on the expression of NLRP3 in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: NLRP3 expression was detected by immunochemistry (×40); B: NLRP3 expression was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsT2DM group;△P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group；##P<0.01vsSLT(H) group.

圖3西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠心臟中NLRP3表達(dá)量的影響

Figure 4. The effect of sitagliptin on SIRT3 expression in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: SIRT3 expression was detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for SIRT3 staining); B: SIRT3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsT2DM group；△P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group.

圖4西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠心臟中SIRT3的表達(dá)量的影響

綜上所述，西格列汀能抑制糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡從而抑制DCM，該作用機(jī)制可能與西格列汀上調(diào)糖尿病心肌組織細(xì)胞SIRT3活性或表達(dá)，從而抑制NLRP3的表達(dá)及細(xì)胞焦亡。然而，具體的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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