徐珊 李任強(qiáng) 鄭振華 張?jiān)?孫愛君 胡云峰

（1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；2. 暨南大學(xué)生物工程學(xué)系，廣州 510632；3. 日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院 海洋工程學(xué)院，日照 276826）

蛋白酶是一類能夠催化水解肽鍵的酶，基本可分為酸性、中性、堿性蛋白酶3種，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如醫(yī)藥、皮革、食品加工、飼料、洗滌劑等多個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域［1-4］，其來源廣泛，主要存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉及果實(shí)和微生物中［5］。相比較于利用動(dòng)植物生產(chǎn)蛋白酶，微生物生產(chǎn)蛋白酶具有高產(chǎn)菌株選育簡單快速，培養(yǎng)條件簡單易擴(kuò)大培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短，且產(chǎn)出的蛋白酶多為胞外酶，分離純化簡單經(jīng)濟(jì)，是工業(yè)蛋白酶的重要來源［6］。

海洋是生命的起源地，不僅面積廣闊，而且蘊(yùn)藏著極為豐富的微生物資源。在海沉積環(huán)境、紅樹林以及深海熱液噴口、冷泉口等，都發(fā)現(xiàn)了新穎微生物的存在［7］。利用豐富的海洋資源，從種類繁多的海洋微生物中分離純化出生物酶制劑，已經(jīng)成為國內(nèi)外酶制劑研究領(lǐng)域的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)［8］。目前已分離得到的海洋微生物酶有：蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、DNA聚合酶和溶菌酶等［9］。且由于海洋特殊的極端環(huán)境，與陸地微生物產(chǎn)的蛋白酶相比較，海洋來源的酶通常具有耐鹽、耐堿、耐熱和耐低溫等優(yōu)良特性。

從大亞灣紅樹林土壤樣品中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶菌株，鑒定該蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)，并對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得優(yōu)良性能的海洋微生物蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大亞灣紅樹林根際土壤分離得到產(chǎn)蛋白酶菌株DH-2。

1.1.2 培養(yǎng)基 脫脂奶粉培養(yǎng)基：配置1%瓊脂糖、1%脫脂奶粉溶液，高壓滅菌待冷卻到合適溫度后倒平板。種子培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：可溶性淀粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.5 g，pH 為 7.0。

1.1.3 試劑 實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩［10］在無菌操作環(huán)境下，取一定量土壤于試管中，加入10 mL無菌水，在37℃，150 r/min條件下震蕩1 h，靜置一定時(shí)間后，取上清液1 mL，依次梯度稀釋成10-1、10-2和10-3，取200 μL各梯度的稀釋樣品，分別涂布于脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行組，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察平板長出的菌落以及其周圍形成的透明圈大小。選取菌落周圍具有明顯蛋白水解圈的菌株于平板進(jìn)行3次以上畫線純化培養(yǎng)，直至純化后保菌。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩 挑選平板上水解圈較大的菌株接入種子培養(yǎng)基，200 r/min，37℃培養(yǎng)24 h。然后按照1%的接種量，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min，37℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液12 000 r/min離心制得粗酶液，測定其酶活，選取酶活最高的菌株進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.2.3 酶活測定 采用國標(biāo) GB /T23527-2009 規(guī)定的福林酚顯色法測定蛋白酶活［11］。酶活定義：40℃，pH7.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量即為1個(gè)蛋白酶活力單位［12］

1.2.4 菌株16S rRNA序列測定 采用16S rRNA通用 引 物 27F ：5′-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3′；和1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì) 其 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，循環(huán) 30 次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行檢測，然后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用BLAST獲 得 相近的菌株 16S rRNA 序列，然后利用Mega 5.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 DH-2菌株生長曲線測定 1%的接種量于發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min，37℃培養(yǎng)，每隔2 h測定其生物量 OD600。

1.2.6 粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.2.6.1 蛋白酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 發(fā)酵粗酶液經(jīng)過高速離心后稀釋一定倍數(shù)，在不同pH（5、6、7、8、9和10）條件下測定其酶活，粗酶液在不同pH（3-10）下置于4℃冰箱12 h，測定殘余酶活，檢測其pH穩(wěn)定性。

1.2.6.2 蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 發(fā)酵粗酶液在高速離心后稀釋一定倍數(shù)，在不同溫度（40-75℃）水浴條件下測定其酶活，以確定其最適反應(yīng)溫度。粗酶液在（25-60℃）條件下水浴處理1 h，然后測定其剩余酶活，查看粗酶液的熱穩(wěn)定性。

1.2.6.3 金屬離子、有機(jī)溶劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶酶活的影響 將稀釋后的粗酶液與不同金屬離子 混 合（Na+、Li+、K+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Cu2+和 Mn2+），使其終濃度達(dá)到 5 mmol/L；與不同有機(jī)溶劑混合（甲醇、乙醇、正丁醇、正庚醇、正癸醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、甲苯和四氫呋喃），使其終濃度為10%（V/V）；與不同表面活性劑混合（Triton-100、Tween-20、tween-80、SDS、SDBS和三聚磷酸鈉），使其終濃度為0.1%（V/V），對(duì)照組加水處理。各組都在室溫下處理2 h，然后在最適條件下測定各組的酶活，考察其對(duì)蛋白酶酶活的影響。

1.2.7 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的確定 單因素試驗(yàn)研究不同碳源（葡萄糖、木糖、可容性淀粉、麥芽糖和蔗糖），不同氮源（酵母提取粉、牛肉膏、酵母粉、氯化銨和硫酸銨），不同碳源含量（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%），不同氮源含量（0、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%），不同初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）和不同氯化鈉含量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）對(duì)DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后按照1%的接種量，37℃，200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，然后測定酶活，以每組中酶活最高的為100%。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.8 菌株發(fā)酵條件的確定 單因素試驗(yàn)研究不同發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84h和96 h），不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%）和不同發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃和45℃）對(duì)DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最適發(fā)酵條件。

2 結(jié)果

2.1 篩選結(jié)果

復(fù)篩過程中，得到一株產(chǎn)蛋白酶酶活較高的菌株，其酶活約為30 U/mL，標(biāo)記為DH-2。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株DH-2的16S rRNA與NCBI數(shù)據(jù)庫上已知的菌株的16S rRNA對(duì)比，結(jié)果顯示其與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis NJ1的16S rRNA的同源性達(dá)到99%。由圖1可知，菌株DH-2與Bacillus subtilis NJ1處在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的同一分支上。

圖1 基于16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 DH-2菌株生長曲線測定

在4-10 h，菌液的OD值隨著時(shí)間的增加呈指數(shù)增長，10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，之后逐漸進(jìn)入衰亡期（圖 2）。

2.4 發(fā)酵液中的蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)測定

2.4.1 發(fā)酵蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)pH和pH耐受性 由圖3-A可知，該蛋白酶在pH 8.0有最高的催化活性；在pH 6.0-9.0時(shí)，相對(duì)酶活都保持在80%以上，能夠發(fā)揮較大的催化活性；在pH為10.0時(shí)，該蛋白酶仍能保持75%的相對(duì)酶活。由圖3-B可知，在pH為4-9之間時(shí)，該酶較為穩(wěn)定；pH小于4或大于10時(shí)，嚴(yán)重失活。

2.4.2 發(fā)酵蛋白酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 由圖3-C可知，在較低溫度下，蛋白酶隨著溫度的升高酶活逐漸增大，在65℃時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)溫度大于65℃后，酶的蛋白結(jié)構(gòu)受到高溫的影響，酶活性有所降低。由圖3-D可知，粗酶液稀釋一定倍數(shù)后在不同溫度梯度下水浴處理60 min，然后在最適反應(yīng)條件下測定其剩余酶活，對(duì)照組放置在4℃處理，并以對(duì)照組的酶活定義為100%。蛋白酶在25-40℃條件下處理后酶活不受影響，45-50℃處理后仍保持80%以上的催化活性，之后隨著處理溫度的升高，酶活有損失。

圖2 DH-2菌株的生長曲線

圖3 發(fā)酵液中蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)測定

2.4.3 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響 由表1可知，5 mmol/L的 Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+和 Li+對(duì)酶活性具有一定的促進(jìn)作用，其余金屬離子對(duì)該酶的活性影響較小，總體上該蛋白酶對(duì)所檢測的金屬離子均有很好的耐受性。

2.4.4 有機(jī)溶劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活性的影響 由表2可知，該蛋白酶對(duì)所檢測的有機(jī)溶劑均具有較好的耐受性，蛋白酶活性受有機(jī)溶劑的影響較小。由表3可知，該蛋白酶對(duì)所檢測的表面活性劑均具有較好的耐受性，其中Tween-80對(duì)該酶的活性具有一定的促進(jìn)作用。

表1 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響

表2 有機(jī)溶劑對(duì)蛋白酶活性的影響

表3 表面活性劑對(duì)蛋白酶活性的影響

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.5.1 碳源的確定 碳源不僅供給微生物生長所需的能量，還對(duì)微生物的產(chǎn)酶具有誘導(dǎo)或是阻遏作用。因此，我們需要對(duì)培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行選擇，從而獲得適合菌株生長和產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基。由圖4-A可知，菌株在可溶性淀粉作為碳源的發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶情況最好。

2.5.2 氮源的確定 影響蛋白酶產(chǎn)酶的另外一個(gè)重要因素是氮源。由圖4-B可知，該菌株選擇性利用有機(jī)氮源作為能量物質(zhì)，幾乎無法利用無機(jī)氮源進(jìn)行生長和生產(chǎn)，其中對(duì)胰蛋白胨的利用較為高效，產(chǎn)酶情況最好，因此選擇胰蛋白胨作為氮源。

2.5.3 碳源和氮源含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 碳源和氮源的含量對(duì)菌株發(fā)酵液具有一定的影響。因此，在確定最佳碳源和氮源后，分別設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究其最適濃度。由圖4-C可知，可溶性淀粉含量為0.5%時(shí)發(fā)酵液有最大酶活，隨著其含量的繼續(xù)增大，其酶活先下降后保持不變。由圖4-D可知，高濃度的胰蛋白胨不僅不能促進(jìn)菌株的產(chǎn)酶，反而對(duì)其有抑制作用，因此確定胰蛋白胨含量為1%。

2.5.4 初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 分析圖4-E，菌株在初始pH為5.0-6.0時(shí)產(chǎn)酶情況較為穩(wěn)定，當(dāng)pH＞6.0或＜5.0時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶的量顯著下降，由此可知pH過高或過低都不利于菌株的產(chǎn)酶，因此選擇發(fā)酵液的初始pH為5.5。

2.5.5 NaCl濃度的確定 由圖4-F可知，在一定濃度范圍內(nèi)，菌株的產(chǎn)酶情況受NaCl濃度的影響較小，產(chǎn)酶較為穩(wěn)定，其中當(dāng)發(fā)酵液的NaCl濃度在低于1%左右時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶具有較好的促進(jìn)作用，但當(dāng)NaCl濃度較高時(shí)對(duì)菌株的產(chǎn)酶具有抑制作用。

2.5.6 優(yōu)化培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9（34）正交試驗(yàn)研究碳源、氮源、pH值和NaCl這4個(gè)因素對(duì)DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。由表4可知，DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，發(fā)酵液初始pH 5.5，NaCl 10 g/L。各因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，由大到小依次為氮源含量、碳源含量、pH值、NaCl濃度。

2.6 發(fā)酵條件的確定

2.6.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 根據(jù)圖5-A結(jié)果，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，菌株所產(chǎn)蛋白酶的量不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36-48 h時(shí)，蛋白酶活力基本達(dá)到最大值，之后再延長發(fā)酵時(shí)間，蛋白酶活力呈下降的趨勢。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇36 h。

2.6.2 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 圖5-B表明，菌液的接種量對(duì)DH-2菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響不大，接種量在6%-8%時(shí)菌株產(chǎn)酶情況基本相同，在8%時(shí)發(fā)酵液酶活有最大值。

2.6.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖5-C可知，該菌株在較低溫度（低于25℃）下基本不產(chǎn)蛋白酶，隨著溫度的不斷升高，菌株所產(chǎn)蛋白酶活力不斷增大，當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)蛋白酶活力最大。此后隨著溫度的升高，酶活略有下降，但影響很小。

2.6.4 優(yōu)化發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9（34）正交試驗(yàn)研究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量3個(gè)因素對(duì)DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。由表5可知，DH-2菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時(shí)間為36 h，接種量為7%，各因素主次順序?yàn)镃＞B＞A。該菌株分泌的胞外蛋白酶在最適培養(yǎng)基和反應(yīng)條件下的酶活為236.30 U/mL，是初篩中表現(xiàn)的酶活的近8倍。

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

圖5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3 討論

海洋來源微生物所產(chǎn)的酶類通常具有較好的穩(wěn)定性，適合工業(yè)化應(yīng)用，是當(dāng)下的一個(gè)研究熱點(diǎn)。Chellappan 等［13］從海 洋 微 生 物 Engyodontium album BTMFS10 中分離到產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的菌株，該蛋白酶具有良好的熱穩(wěn)定性，在60℃保存8 h后仍保持80%以上的酶活；并且對(duì)大多數(shù)有機(jī)溶劑、表面活性劑顯示出較好的耐受性。Hames-Kocabas等［14］從土耳其伊茲密爾灣海洋沉積物樣品中分離得到一株產(chǎn)蛋白酶的放射菌MA1-1，該蛋白酶在pH（8.0-13.0）和較高溫度（35-50℃）條件下具有較好的酶活性。Amoozegar等［15］從NaCl含量為17%的湖水中篩選得到鹽弧菌AF-2004菌株，它產(chǎn)生的蛋白酶具有高耐鹽性，在初始NaCl濃度為10%時(shí)產(chǎn)酶效果達(dá)到最佳狀態(tài)（NaCl濃度為1%）的70%以上，且同時(shí)具有較為寬廣的反應(yīng)pH（5.0-10.0）。這些海洋或者極端環(huán)境獲得的蛋白酶都具有良好的耐鹽、耐熱等性能，顯示出較好的穩(wěn)定性，是許多陸地微生物蛋白酶所不能比擬的。

紅樹林是具有豐富而特殊微生物資源的海洋生態(tài)環(huán)境，本研究從大亞灣紅樹林樣品中篩選到一株產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株DH-2，經(jīng)測定，該蛋白酶的粗酶液表現(xiàn)出良好的耐熱性，并且對(duì)多種金屬離子、有機(jī)溶劑和表面活性劑中所具有的高耐受性，使其在洗滌業(yè)和紡織業(yè)等眾多工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛能。由于游離酶本身存在的穩(wěn)定性差、分離回收困難和難以實(shí)現(xiàn)反復(fù)連續(xù)利用等缺陷，很大程度上限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用，將其制備成固定化酶很有必要［16-18］。本課題后續(xù)將對(duì)該海洋菌株所產(chǎn)蛋白酶進(jìn)行分離純化以及固定化制劑研究，以期實(shí)現(xiàn)該海洋微生物蛋白酶的產(chǎn)業(yè)化制備。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

從大亞灣紅樹林分離得到的枯草芽孢桿菌菌株DH-2，其最佳發(fā)酵條件是1%（m/V，下同）可溶性淀粉，1%胰蛋白胨、1% NaCl，初始發(fā)酵pH 5.5，7%的接種量，在40℃培養(yǎng)36 h。在最適條件下，測得發(fā)酵液的酶活為236.30 U/mL，約為初篩時(shí)的酶活的8倍。該菌株分泌的蛋白酶最適反應(yīng)pH和溫度分別為8.0和65℃，50℃處理1 h 后，仍保留80%以上的相對(duì)酶活。該蛋白酶具有較為寬廣的作用pH，pH在6.0-9.0時(shí)能發(fā)揮80%以上的相對(duì)酶活；作用溫度范圍廣，在40-70℃時(shí)，能發(fā)揮75%以上的相對(duì)酶活。同時(shí)，該蛋白酶對(duì)多種金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑均有較好的耐受性。

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