王亞茹 梁曉 伍春玲 陳青 趙惠萍

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南省熱帶作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心 熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

木瓜秀粉蚧（Paracoccusmarginatus Williams and Granara de Willink），又名木瓜粉蚧，屬半翅目Hemi-ptera，粉蚧科Pseudococcidae，秀粉蚧屬Paracoccus，是重要的世界危險(xiǎn)性檢疫有害生物，其寄主多達(dá)35個(gè)科，超過(guò)55個(gè)屬［1-2］。該蟲主要以若蟲和雌成蟲刺吸為害植物的莖葉和果實(shí)，造成葉片褪綠黃化，枝條干枯，果實(shí)品質(zhì)下降，危害損失可達(dá)20-80%，嚴(yán)重時(shí)整株死亡［3］。木瓜秀粉蚧原產(chǎn)于墨西哥和中美洲地區(qū)，目前在我國(guó)云南、海南、廣西、廣東及臺(tái)灣等地造成的為害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)啬臼?、木瓜產(chǎn)業(yè)可續(xù)持發(fā)展［4］。

寄主植物所含次生代謝物質(zhì)對(duì)害蟲具有驅(qū)避、抑食甚至致死效應(yīng)，而對(duì)應(yīng)地害蟲在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中體內(nèi)形成了一套保護(hù)酶系統(tǒng)以形成寄主取食選擇性。目前，研究較多的保護(hù)酶系主要有過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）［5］。大量研究表明，害蟲取食寄主作物時(shí)其體內(nèi)保護(hù)酶活性顯著升高可以減輕或者免受寄主有毒物質(zhì)毒害，這在木薯-朱砂葉螨（SOD、CAT）［6］、桃蚜 -辣椒（SOD、CAT、POD）［7］、棉蚜 - 西瓜（SOD、CAT）［8］、茶尺蠖 - 茶樹（PPO）［9］、的互作研究中得到了印證。而害蟲保護(hù)酶活性顯著被抑制則不利于其進(jìn)一步取食為害，這在木薯-二斑葉螨（POD、PPO）［10］，橡膠樹 - 六點(diǎn)始葉螨（SOD、CAT）［11］的互作研究中被證實(shí)。然而迄今為止，尚缺乏木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種前后保護(hù)酶活性變化的研究，以致無(wú)法深入了解木瓜秀粉蚧的寄主選擇性機(jī)理。因此，本研究分析測(cè)定了木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種前后保護(hù)酶POD、PPO、CAT和SOD活性變化，旨為深入探討木瓜秀粉蚧的寄主選擇性機(jī)理奠定良好的前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試粉蚧 木瓜秀粉蚧P.marginatus為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所特色熱帶作物害蟲研究室室內(nèi)用木薯品種BRA900繼代飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)種群。將木瓜秀粉蚧按每葉100頭雌成蟲分別接于長(zhǎng)×寬為25 cm × 19 cm的白瓷盤中濕潤(rùn)海綿上的不同木薯品種葉片背面，并飼養(yǎng)于25±1℃、相對(duì)濕度為75±5%、光照周期14（L）：10（D）的人工氣候箱中。飼養(yǎng)48 h后收集發(fā)育一致的雌成蟲用于酶液提取，每個(gè)品種設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.1.2 供試木薯品種 木薯品種BRA900，SC205、ZM9066、C1115、瑞士F21和緬甸種均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃提供，其中BRA900為本研究的對(duì)照品種。

1.2 方法

1.2.1 酶液提取 將各處理木瓜秀粉蚧，在冰浴狀態(tài)下按100頭/1.5 mL用20%的滅菌蔗糖溶液提?。?.5 mL研磨，再分別用0.5 mL洗兩次），然后將提取液置于2 mL離心管中，在4℃條件下7 000 r/min離心15 min，取上清液并用20%的滅菌蔗糖溶液定容至2 mL，置于-20℃保存，用于POD、PPO、CAT和SOD活性測(cè)定。

1.2.2 POD活性測(cè)定 參考陳青等［12］方法。在1.5 mL離心管中依次加入0.2 mL醋酸緩沖液（0.2mol/L，pH 5.0），0.1 mL 1 g/L鄰甲氧基苯酚，0.04 mL酶液，0.1 mL 0.08%的過(guò)氧化氫溶液，而對(duì)照管中將過(guò)氧化氫溶液改為0.1 mL蒸餾水，反應(yīng)60 min，470 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.2.3 PPO活性測(cè)定 參考Liang等［10］方法。在1.5mL離心管中依次加入0.2 mL 0.02 mol/L鄰苯二酚溶液，0.2 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.8），0.05 mL酶液，而對(duì)照管中不加酶液處理。在30℃下反應(yīng)2 min，398 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.2.4 CAT活性測(cè)定 參考Lu等［6］方法。在1.5mL離心管中依次加入0.2 mL磷酸緩沖液（pH 7.2），0.133 3 mL過(guò)氧化氫溶液（0.1 mol/L），0.04 mL酶液，而對(duì)照管將酶液改為0.04 mL蒸餾水。于30℃水浴15 min后，用10%硫酸0.266 7 mL終止反應(yīng)，搖勻，在415 nm下測(cè)OD值。

1.2.5 SOD活性測(cè)定 參照Lu等［6］的方法。鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：吸取1.50 mL Tris緩沖溶液于一個(gè)1.5 mL離心管中作為零管，另吸取1.45 mL Tris緩沖溶液于另一個(gè)1.5 mL離心管中作為測(cè)定管。將兩離心管放入25℃恒溫水浴10 min后取出，于測(cè)定管中加入0.05 mL鄰苯三酚溶液，迅速混勻，立即于 325 nm 波長(zhǎng)，以零管調(diào)零，在4 min內(nèi)每30 s測(cè)OD值一次。

1.2.6 樣品測(cè)定 吸取Tris緩沖溶液1.00 mL于一個(gè)1 cm石英比色杯中，作為零管；另吸取Tris緩沖溶液0.933 mL于另一個(gè)1 cm石英比色杯中，作為測(cè)定管。將兩比色杯放入 25℃恒溫水浴中，10 min后取出，于測(cè)定管中加入0.10 mL樣品濾液，混勻，再加入0.033 mL鄰苯三酚溶液，迅速混勻，立即于325 nm波長(zhǎng)，以零管調(diào)零，在4 min內(nèi)每30 s測(cè)OD值1次。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS軟件Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，比較和統(tǒng)計(jì)分析取食不同木薯品種后木瓜秀粉蚧雌成蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性相對(duì)比率（%），其中木瓜秀粉蚧取食對(duì)照木薯品種BRA900后的保護(hù)酶活性設(shè)定為100%，取食其它木薯品種后的對(duì)應(yīng)保護(hù)酶活性相對(duì)比率（%）=取食其他木薯品種保護(hù)酶活性/取食對(duì)照木薯品種BRA900保護(hù)酶活性×100%。顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種前后雌成蟲體內(nèi)POD活性差異分析

由圖1可以看出，取食不同品種木薯葉片后木瓜秀粉蚧體內(nèi)POD活性存在顯著差異。與取食木薯品種BRA900相比，取食SC205和ZM9066品種后木瓜秀粉蚧體內(nèi)POD活性無(wú)顯著差異，而取食C1115、瑞士F21和緬甸種后蟲體內(nèi)POD活性僅分別為取食BRA900后POD活性的44.0%、42.2%和43.8%并且差異顯著（P＜0.05）。

圖1 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種后POD活性差異

2.2 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種前后雌成蟲體內(nèi)PPO活性差異分析

由圖2可以看出，取食不同品種木薯葉片后的木瓜秀粉蚧體內(nèi)PPO活性存在顯著差異。與取食木薯品種BRA900相比，取食SC205和ZM9066品種后木瓜秀粉蚧體內(nèi)PPO活性無(wú)顯著差異，而取食C1115、瑞士F21和緬甸種后蟲體內(nèi)POD活性僅分別為取食BRA900后PPO活性的62.3%、62.7%和63.5%并且差異顯著（P＜0.05）。

圖2 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種后PPO活性差異

圖3 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種后CAT活性差異

2.3 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種前后雌成蟲體內(nèi)CAT活性差異分析

由圖3可以看出，取食不同品種木薯葉片后的木瓜秀粉蚧體內(nèi)CAT活性存在顯著差異。與取食木薯品種BRA900相比，取食SC205和ZM9066品種后木瓜秀粉蚧體內(nèi)CAT活性無(wú)顯著差異，而取食C1115、瑞士F21和緬甸種后蟲體內(nèi)CAT活性僅分別為取食BRA900后CAT活性的52.9%、35.9%和44.0%并且差異顯著（P＜0.05）。

2.4 木瓜秀粉蚧取食不同品種后體內(nèi)SOD活性差異分析

由圖4可以看出，取食不同品種木薯葉片后的木瓜秀粉蚧體內(nèi)SOD活性存在顯著差異。與取食木薯品種BRA900相比，取食SC205和ZM9066品種后木瓜秀粉蚧體內(nèi)SOD活性無(wú)顯著差異，而取食C1115、瑞士F21和緬甸種后蟲體內(nèi)SOD活性僅分別為取食BRA900后SOD活性的55.7%、50.3%和50.8%并且差異顯著（P＜0.05）。

POD、PPO、CAT和SOD活性差異分析結(jié)果一致，木薯品種C1115、瑞士F21和緬甸種對(duì)木瓜秀粉蚧體內(nèi)SOD活性具有顯著抑制作用，不適宜木瓜秀粉蚧取食，而SC205、ZM9066和BRA900對(duì)木瓜秀粉蚧體內(nèi)SOD活性無(wú)顯著抑制作用，均適宜木瓜秀粉蚧取食。

圖4 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種后SOD活性差異

3 討論

作物被害蟲為害時(shí)，體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)能夠?qū)οx產(chǎn)生趨避和抑食作用［13-14］，其中一個(gè)重要的途徑是抑制害蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性［15-16］。在害蟲體內(nèi)，SOD是害蟲對(duì)抗活性氧自由基（Reacticve oxygen species，ROS）為害的第一道防線［17］，CAT和POD將活性氧分解為水和氧氣以減輕氧化損傷［18］，而PPO則是昆蟲體內(nèi)重要的免疫蛋白［19］。這些保護(hù)酶一旦被抑制，將極大影響害蟲對(duì)作物的取食能力。例如對(duì)森林天幕毒蛾和白斑毒蛾的研究表明［20］，兩種毒蛾取食寄主植物時(shí)攝入的單寧酸均能夠顯著抑制中腸SOD、CAT和POD的活性而不利于其為害。劉佳妮等［15］研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食含有煙堿的寄主植物后SOD和CAT活性被顯著抑制，且抑制隨著飼養(yǎng)代數(shù)的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。Aucoin［21］研究發(fā)現(xiàn) 缺口尺蛾幼蟲取食富含金絲桃素的貫葉連翹后發(fā)現(xiàn)POD和PPO的活性均受到顯著抑制，并且抑制程度與攝入的濃度大小成正比。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，朱砂葉螨取食抗螨木薯品種后，體內(nèi)SOD、CAT、POD和PPO活性均被顯著抑制，而取食感螨木薯品種后活性無(wú)顯著變化［6，10］；六點(diǎn)始葉螨取食抗螨橡膠樹品種后，同樣發(fā)現(xiàn)體內(nèi)上述4種保護(hù)酶的活性與取食感螨橡膠樹品種相比收到顯著抑制［11］。本研究結(jié)果表明，取食不同木薯品種后木瓜秀粉蚧體內(nèi)的保護(hù)酶存在明顯差異，取食木薯品種C1115、瑞士F21和緬甸種的木瓜秀粉蚧體內(nèi)POD、PPO、SOD和CAT的活性較取食品種BRA900、SC205和ZM9066的木瓜秀粉蚧保護(hù)酶活性顯著降低，表明木瓜秀粉蚧取食BRA900、SC205和ZM9066后能夠正常啟動(dòng)活性氧清除機(jī)制以應(yīng)對(duì)攝入的次生代謝物質(zhì)造成的氧化損傷，從而有利于其在上述3種木薯品種上發(fā)生為害，而攝入C1115、瑞士F21和緬甸種后木瓜秀粉蚧自身保護(hù)機(jī)制受到顯著抑制，不適宜木瓜秀粉蚧取食，

本研究中木瓜秀粉蚧4種保護(hù)酶受到顯著抑制的變化趨勢(shì)與此前在木薯和橡膠害螨上的研究結(jié)果相似，但由于寄主和害蟲（螨）種類的差別，其機(jī)理是否具有一致性仍有待進(jìn)一步研究。此外，吳豐年［22］等研究了不同離體寄主及對(duì)亞洲柑桔木虱存活的影響，發(fā)現(xiàn)九里香嫩梢離體后對(duì)卵的孵化率影響較大，而酸桔和馬水桔離體葉片使柑桔木虱若蟲的發(fā)育歷期延長(zhǎng)，作者推斷這可能與離體葉片營(yíng)養(yǎng)成分較植株缺乏有關(guān)。因此，本研究采用離體木薯葉片展開平行試驗(yàn)雖然也能反應(yīng)出木瓜秀粉蚧對(duì)不同寄主植物的潛在取食趨性，為深入探討其寄主選擇性奠定前期工作基礎(chǔ)。后續(xù)研究中還應(yīng)進(jìn)一步考慮離體葉片飼養(yǎng)對(duì)木瓜秀粉蚧生長(zhǎng)發(fā)育及保護(hù)酶活性的影響，以便全面客觀反應(yīng)木瓜秀粉蚧取食不同木薯葉片的保護(hù)酶變化趨勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)木瓜秀粉蚧取食木薯品種C1115、瑞士F21和緬甸種后體內(nèi)POD、PPO、SOD和CAT的活性較取食品種BRA900、SC205和ZM9066的木瓜秀粉蚧相同保護(hù)酶活性顯著降低（P＜0.05），表明BRA900、SC205和ZM9066對(duì)該蟲保護(hù)酶活性無(wú)顯著抑制作用，易于被取食為害，而C1115、瑞士F21和緬甸種因其對(duì)保護(hù)酶的較強(qiáng)抑制作用不利于其取食。

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