潘潔明 張榮意 鄧加艾 譚志瓊

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）耐藥性強(qiáng)，能夠引起致死性感染，危害性十分嚴(yán)重，已經(jīng)成為臨床抗菌感染治療的首要難題，并與乙型肝炎、艾滋病一起被稱為當(dāng)今世界三大感染頑疾，給人類帶來了極大危害［1-2］。自1961年英國Jevons發(fā)現(xiàn)首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA以來［3］，在歐美、亞洲等各地相繼出現(xiàn)MRSA所致的感染，到20世紀(jì)80年代，有關(guān)MRSA的感染幾乎遍及全球，成為臨床上最常見的病原菌之一。MRSA本在醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室和外科手術(shù)室中泛濫，但據(jù)最近報道，其已從醫(yī)院擴(kuò)散到社區(qū)人群和食用動物之中［4-5］。自Saravolatz等［6］首次報道社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Community-acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA）感染后，CA-MRSA感染病例在全球陸續(xù)被報道，MRSA已嚴(yán)重威脅人類的健康。

MRSA一般具有多重耐藥特征，MRSA感染已引起世界范圍的廣泛關(guān)注，目前治療MRSA感染的抗生素十分有限，僅有萬古霉素和利奈唑胺［7］。但最近的研究結(jié)果表明，新的抗萬古霉素和利奈唑胺的MRSA已經(jīng)出現(xiàn)［8］。因此，面對MRSA耐藥性的日趨嚴(yán)重，尋找和開發(fā)高效抑制MRSA的抗生素顯得相當(dāng)重要［9-10］。放線菌（Actinomycetes）是產(chǎn)生抗生素最多的一類微生物，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素80%是由放線菌產(chǎn)生的［11］。鸚歌嶺位于海南省樂東縣，海拔1 811 m，山高坡陡，交通閉塞，人煙稀少，絕大部分從未有過正規(guī)和大規(guī)模的開發(fā)利用，表現(xiàn)出非常明顯的原始特征，生物多樣性極其豐富［12］，目前對放線菌的研究未見報道。其中可能蘊(yùn)藏著抗MRSA的豐富放線菌資源。本研究從鸚歌嶺土壤中分離、篩選抗MRSA的放線菌，并對其進(jìn)行初步鑒定和抗菌活性物質(zhì)研究，目的是從中發(fā)現(xiàn)新的抗MRSA的放線菌及其活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品土壤 本實驗所用的土壤采自海南省樂東縣原始熱帶雨林鸚歌嶺。采樣深度為20 cm，土壤表面覆蓋茂盛的喬木（表1）。

1.1.2 供試菌株 MRSA ATCC 9551由海南省藥監(jiān)所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基用于分離培養(yǎng)土壤放線菌，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于MRSA的培養(yǎng)和測定，高氏一號液體培養(yǎng)基用于菌株發(fā)酵［13］。

表1 土壤樣品

1.2 方法

1.2.1 土壤中拮抗放線菌的分離與篩選 采用平板稀釋法分離各土壤樣本中的放線菌［14］。取濃度為10-3、10-4和10-5的土壤懸浮液200 μL加入至高氏一號培養(yǎng)基（加入70 μg/mL重鉻酸鉀來抑制細(xì)菌和真菌）上，并用無菌的涂布棒涂布均勻，貼好標(biāo)簽，28℃培養(yǎng)7-10 d。待長出放線菌菌落后，挑取不同類型的菌落在高氏一號試管斜面上保存。采用瓊脂塊法篩選抗MRSA的菌株：將斜面上的MRSA用無菌水制成懸浮液，并與45℃牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基充分混勻后倒平板，將高氏1號平板上已經(jīng)培養(yǎng)好的放線菌打菌塊（6 mm），然后挑取至含MRSA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24-48 h，觀察拮抗效果［15-16］。挑取拮抗性好的放線菌進(jìn)行純化，復(fù)篩，保存。

1.2.2 抗MRSA菌株發(fā)酵粗提物的制備 將篩選出的菌株接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)8 d，取分生孢子制備孢子懸浮液，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法，將懸浮液接種到裝有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的錐形瓶（100 mL/250 mL）中，于28℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，然后用8層滅菌紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，菌絲體用70%的乙醇浸泡48 h，減壓濃縮后，用水溶解，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓蒸餾濃縮可得到乙酸乙酯粗提物，用甲醇溶解，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 粗提液對MRSA的抑菌作用 采用濾紙片法測定粗提液對MRSA的抑菌活性。將MRSA與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合后倒平板，用移液槍分別吸取5 μL粗提液加到滅菌濾紙片（6 mm）上，將該加樣的濾紙片放置到帶MRSA的平板上，每個平皿3個重復(fù)，然后置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48 h，觀察拮抗效果，同時用甲醇作對照。

1.2.4 抗MRSA菌株的16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 采用OMEGA公司細(xì)菌DNA提取試劑盒（D3350-01）提取菌株基因組DNA［17］。引物序列 如 下 ：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。 擴(kuò) 增反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中包括Genomic DNA 1μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PCR-Mixture 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃，5 min；變性，94℃，30 s；退火，52℃，30 s；延伸，72℃，1 min；35個循環(huán)；終止延伸，72℃，10 min；4℃保存［18］。將PCR測序產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序，結(jié)果用BLAST軟件比對，查找相似性最高的同源菌株，并利用Mega6.0［19］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 HPLC指紋圖譜的建立 用安捷倫高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC）檢測分析發(fā)酵液粗提物的指紋圖譜，安捷倫DADG1315D檢測器，色譜柱YMC-packed C 18（5 mm，250 mm× 4.6 mm）。在HPLC上以相同的條件進(jìn)行梯度洗脫（1 mL/min，10%甲醇10 min，10%-100%甲醇，20min，100%甲醇5 min，總時間35 min）。

2 結(jié)果

2.1 拮抗放線菌的分離與篩選

從10份土壤樣本中共分離到168株放線菌，其中10株具有較強(qiáng)的抗MRSA活性（表2）。由表2可知，放線菌菌塊的抑菌直徑在17-31 mm之間，抗MRSA能力強(qiáng)。根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》可知，抑菌效果主要有3個等級，抑菌直徑在20 mm以上為抑菌效果強(qiáng)，在10-20 mm為抑菌效果中等，在10 mm以下為抑菌效果弱。由此可見，該10株放線菌中有4株為強(qiáng)抑菌菌株，6株為中等抑菌菌株。

液體發(fā)酵的乙酸乙酯粗提物對MRSA抑菌結(jié)果見表2。菌株7抑菌直徑達(dá)到25 mm，抑菌能力強(qiáng)，表明產(chǎn)生了高活性的抗菌物質(zhì)；菌株5抑菌直徑為15 mm，抑菌能力僅次于菌株7；菌株8-1、8-4抑菌直徑分別為10 mm和11 mm，抑菌能力中等，而菌株8-3、9-1、4-1、4-2、3-13和3-14抑菌直徑小于10 mm，抑菌能力弱。由此可見，菌株7、菌株5值得進(jìn)一步深入研究。

表2 放線菌對MRSA的抑菌效果

表3 抗MRSA放線菌分離菌株的分子鑒定

2.2 抗MRSA菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得10株具有抗MRSA菌株16S rDNA序列均在1 400 bp左右，其在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與這10株菌相似率最高的均為鏈霉菌（Streptomyces），均達(dá)到99%（表3），初步判斷這10株放線菌均為鏈霉菌。用Mega 6.0中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），其中菌株9-1、8-4、8-1和4-2與Streptomyces lunalinharesii strain RCQ 1071T聚在一支，相似率98%；菌株7與Streptomyces yunnanensis strainT聚為一支，相似率84%；菌株8-3和菌株5與Streptomyces aureofaciens strain KACC 20180T聚為一支，相似率96%-99%；菌株3-13、3-14、4-1與Streptomyces lateritius strain LMG 19372T聚為一支，相似率95%。

圖1 10株放線菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 抗MRSA菌株的HPLC指紋圖譜

根據(jù)10株放線菌發(fā)酵液粗提物的HPLC指紋圖譜（圖2）發(fā)現(xiàn)，菌株7、菌株5和菌株9-1的主峰出峰時間主要集中在12-27 min，在220-340 nm波長處均有吸收。由圖2可見，發(fā)酵液50%甲醇-水洗脫部分有明顯的次級代物產(chǎn)物峰，顯示3株菌代謝產(chǎn)物均豐富，但是3株菌株的代謝產(chǎn)物有區(qū)別。菌株7在21.6-23.6 min為系列化合物，紫外吸收主要在250 nm左右有強(qiáng)吸收峰；菌株5在23-26 min之間為系列化合物，從紫外吸收圖譜上看，在250 nm，300 nm，440 nm有強(qiáng)吸收峰；菌株9-1在21-26 min有強(qiáng)吸收，從紫外吸收圖譜看，有不同系列的化合物。3株菌株有不同類型的化合物，但3株菌對MRSA均有活性。菌株5的系列化合物最豐富，有可能是抗MRSA的主要成分，有利于構(gòu)效關(guān)系的分析。

3 討論

海南素有“天然大溫室”的美稱，溫高少寒，蘊(yùn)藏著極其豐富的放線菌資源，至今仍未被充分開發(fā)利用［20］。樣品土壤來源于海南省樂東縣鸚歌嶺，該地處熱帶，氣候適宜，微生物豐富。在海南有關(guān)放線菌的分離來源報道主要有霸王嶺和紅樹林土壤［21-22］，而對于鸚歌嶺土壤報道甚少，因此很有可能從這一土壤中得到新的抑菌活性化合物，從而研發(fā)出新型的抗MRSA藥物?？姵卸牛?3］從海南文昌紅樹林保護(hù)區(qū)分離到608株真菌，其中7株具有較強(qiáng)的抗MRSA活性；宓偉等［24］發(fā)現(xiàn)黃連、黃柏、大黃、銀柴胡與石榴皮5種中藥具有較高的抗MRSA作用；唐依莉［25］從清瀾港頭苑村紅樹林保護(hù)區(qū)分離到138株內(nèi)生放線菌，其中27株具有抗MRSA活性；高正航［26］從海南省霸王嶺土壤共分離到287株放線菌，得到抗MRSA活性放線菌35株；黃惠琴［27］從海南、湛江和北海沿海地區(qū)采樣分離獲得放線菌395株，43株有抗MRSA活性。

圖2 菌株7、5、9-1的紫外吸收圖譜（從上到下依次為菌株7、5、9-1）

本研究通過平板稀釋法分離獲得放線菌168株，從中篩選到10株具有抗MRSA的活性菌株，并對篩選菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定、對比，初步確定該放線菌是鏈霉菌屬；采用濾紙片法和高效液相色譜儀檢測粗提液的活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)10株放線菌對MRSA的生長均有明顯的抑制作用。HPLC指紋圖譜顯示菌株7、菌株5、菌株9-1的次級代謝產(chǎn)物十分豐富，且存在系列化合物，其豐富化合物的生物活性很有研究價值，為探尋新的抗MRSA藥物提供依據(jù)。此外分離到的168株放線菌中，對MRSA有拮抗作用的放線菌就高達(dá)10株，說明鸚歌嶺放線菌資源豐富。其特殊的原始森林環(huán)境可能會賦予其特殊的代謝途徑，進(jìn)而獲得新穎的代謝產(chǎn)物。而且，鸚歌嶺不同海拔高度，不同植被覆蓋情況的土壤可能存在更多尚未發(fā)現(xiàn)和利用的抗MRSA放線菌，值得對其開展系統(tǒng)而全面的研究。下一步研究將對具有抗MRSA活性的放線菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，尋找結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)，探尋新的抗生素。

在研究中我們發(fā)現(xiàn)如3-14菌株，其瓊脂塊的抑菌活性很好，可液體發(fā)酵或固體發(fā)酵后，乙酸乙脂粗提物的抑菌活性卻較弱，可能與乙酸乙酯只提取脂溶性活性成分有關(guān)。另外，本研究分離篩選的菌株經(jīng)鑒定為鏈霉菌屬，對MRSA有拮抗作用，但對農(nóng)業(yè)病原菌的作用如何需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從10份鸚歌嶺土壤中分離、篩選到10株具有抗MRSA活性的放線菌，經(jīng)16S rDNA測序比對分析，10株均屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）。7號菌抑菌效果最強(qiáng)，乙酸乙酯粗提物的抑菌圈直徑高達(dá)25 mm，屬強(qiáng)抑菌，其余9株的抑菌直徑在8-15 mm，對MRSA有一定的抑制作用。HPLC指紋圖譜顯示，菌株7、菌株5、菌株9-1在220-340 nm均有吸收，330 nm上存在最大吸收峰，發(fā)酵液次級代謝產(chǎn)物豐富。

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