高潔 佟碩秋 鐘杰 貢獻(xiàn) 吳擁軍

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

同源異型域-亮氨酸拉鏈（Homeodomain-leucine zipper，HD-Zip）是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，包含一個(gè)高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域HD，HD羧基末端緊連著一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域［1］。研究發(fā)現(xiàn)，HDZip轉(zhuǎn)錄因子通過抑制或促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和生長，參與器官、維管束及分生組織的形成，調(diào)控原形成層細(xì)胞的活動(dòng)及形成層細(xì)胞和維管束細(xì)胞的分化，同時(shí)還可調(diào)控激素合成及外界環(huán)境的響應(yīng)［2～4］。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子已在多種草本植物及木本植物中被證明與纖維調(diào)控有關(guān)。單淳敏［5］在2014年鑒定到在纖維快速伸長期特異表達(dá)的HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子GhHOX3，該基因在棉纖維伸長的過程中發(fā)揮決定性作用。阿拉姆等［6］證明編碼來自長蒴黃麻和圓果種黃麻的同源框-亮氨酸拉鏈蛋白hat22能夠修飾，優(yōu)選地增加或增強(qiáng)纖維長度。Du等［7］在2011年證明HD-ZIP類轉(zhuǎn)錄因子PtHB7在楊樹次生木質(zhì)部的分化調(diào)控中起重要作用，是調(diào)控楊樹木質(zhì)部分化的關(guān)鍵基因。根據(jù)DNA結(jié)合特異性、基因結(jié)構(gòu)等特征可將HD-Zip分為HD-ZipⅠ-Ⅳ4個(gè)亞家族，主要參與植物的激素、光信號(hào)、逆境應(yīng)答反應(yīng)以及器官發(fā)育的調(diào)控［8，9］。其中，HD-ZipⅢ已被證明參與調(diào)控維管組織纖維調(diào)控。Zhong等［10］在1999年發(fā)現(xiàn)擬南芥中的5個(gè)HD-ZipⅢ基因在原形成層細(xì)胞和木質(zhì)部細(xì)胞中特異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)顯性突變體rev-10d/avb1和phb-1d的木質(zhì)部包圍韌皮部且維管束數(shù)目顯著增多的現(xiàn)象。王瑞等［11］通過不同組織中表達(dá)譜的分析表明，大多數(shù)HD-ZipⅣ基因優(yōu)先在發(fā)育中的胚珠和纖維中表達(dá)，從而意味著該基因家族可能參與纖維發(fā)育。但HD-ZipⅠ家族中尚未報(bào)到與維管組織纖維調(diào)控有關(guān)。最初鑒定到的HD20屬于HD-Zip型Ⅰ家族，其表達(dá)與干旱和創(chuàng)傷等多重誘導(dǎo)相關(guān)的刺激有關(guān)［12］。目前，有關(guān)煙草HD20結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)功能的研究鮮見報(bào)道。吳擁軍等［13］在2009年將CHIFN-γ轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草具有顯著的抗蟲效果，且莖部維管束較對照發(fā)達(dá)。該實(shí)驗(yàn)室前期通過顯著差異基因的GO和Pathway分析，從轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草中篩選獲得抗蟲相關(guān)候選基因HD20?；蛐酒Y(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草在2個(gè)不同生長時(shí)期中HD20均顯著的上調(diào)表達(dá)［14］。因此，推測轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草莖部纖維細(xì)胞的分化與HD20的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。本研究利用RT-PCR克隆技術(shù)，從煙草中克隆HD20的cDNA序列，對該基因及編碼蛋白氨基酸進(jìn)行序列分析，同時(shí)構(gòu)建含 HD的過表達(dá)載體pSH737-HD并將其遺傳轉(zhuǎn)化至擬南芥，通過石蠟切片觀察其組織變化，為研究HD功能提供了一定的理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究目的基因在引起植物抗蟲反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型煙草K326（Wild Nicotiana tabacum）組織樣本為哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana），由貴州省煙科院提供。植物表達(dá)載體pSH-737、農(nóng)桿菌EHA105為本分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中Homeodomain 20 transcription factor（HD20）mRNA（Accession：HM107874）序列設(shè)計(jì)引物（HD20 F：5′-ATGTTTGATGGAGGGGAATTTTC-3′；HD20 R ：5′-TCAAGACCAGAAATCCCACCACT-3′），由 TaKaRa（大連）公司合成，預(yù)擴(kuò)增片段長度約762 bp。

1.2.2 總RNA的提取和純化 煙草葉片總RNA的提取按照TRIZOl? Reagent試劑盒的操作提?。?5］。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整度。

1.2.3 HD20的克隆及序列分析 以煙草總RNA為模板，Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒一步法直接擴(kuò)增目的片段，RT-PCR體系為50 μL，包括10 mmol/L上下游引物各2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mixc2 μL 和 RNA模板小于1 μg；反應(yīng)程序?yàn)?0℃反轉(zhuǎn)錄30 min，5℃2 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，循環(huán) 30 次；72℃ 10 min。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化。通過菌落PCR與質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，陽性菌液于寶生物公司（大連）測序。

利用Protscale在線軟件對編碼蛋白進(jìn)行疏水性分析。通過NCBI在線軟件Conserved domain對結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，BLASTXP進(jìn)行氨基酸同源性分析。CLUSTALW進(jìn)行氨基酸多序列比對。MEGA 6軟件包中的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Signal P 4.1進(jìn)行信號(hào)肽分析。TMHMM2.進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析。Plant-PLoc進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。SOPMA預(yù)測氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。MEGA6軟件進(jìn)行氨基酸序列進(jìn)化樹分析。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 將含XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物HD MF/HD MR從含有目的基因的T載體上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收后與酶切處理后的pSH-737表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化。通過菌落PCR檢測，挑取檢測結(jié)果為陽性的菌落提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ/XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，具體步驟參照徐錦濤等［16］。

1.2.5 石蠟切片 參照蔡雁峰［17］方法選取野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥新鮮植株相同部位進(jìn)行石蠟切片。

2 結(jié)果

2.1 HD20的克隆

利用引物HD20 F/HD20 R對目的基因進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增（圖1），獲得一條符合預(yù)期大小的目的條帶，測序?yàn)?62 bp，符合預(yù)期結(jié)果。

圖1 煙草HD20的RT-PCR擴(kuò)增

2.2 HD20的生物信息學(xué)分析

HD20的CDS全長762 bp，編碼253個(gè)氨基酸，堿基A、G、T和C的含量分別為32.68%、23.88%、27.30%和16.14%，其中（G+C）所占百分比為40.03%。氨基酸序列分析表明，HD20成熟蛋白的分子式為C1262H1960N352O420S9，分子量為29072.09 kD，理論等電點(diǎn)為4.91，穩(wěn)定系數(shù)為51.26，是一類不穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為62.09，親水性平均數(shù)為-0.967，無跨膜結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，包含2個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域：同源異型結(jié)構(gòu)域HD20（45-95）以及緊隨HD20羧基末端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（97-124）（圖2）。因此HD20屬于HD-Zip家族；亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于細(xì)胞核中（圖3）；同時(shí)，HD20蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，該蛋白是由37.15%的不規(guī)則卷曲、43.08%的α螺旋、10.67%的延伸鏈和9.09%的β轉(zhuǎn)角組成，因此α螺旋為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分。

氨基酸同源序列比對（圖4）顯示，HD20與煙草基因ATHB-12-like同源性一致為100%。ATHB12屬于同源結(jié)構(gòu)域-亮氨酸拉鏈Ⅰ類（HD-ZipⅠ）基因，HD20屬于HD-ZipⅠ亞家族。與其他高等植物ATHB-12-like基因氨基酸比對結(jié)果顯示，HD20編碼的氨基酸序列與辣椒（XP 016538251.1）、馬鈴薯（XP_006339757.1）、 番 茄（XP_004230017.1）、棉花（XP_017629690.1）、番茄（EOX95622.1）、棗（XP_015888788.1） 大豆（XP_003528775.1）和綠豆（XP_014524102.1）編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，分別為74%、72%、69%、68%、62%、61%和58%。說明HD20編碼的氨基酸與各植物中ATHB-12-like編碼的氨基酸序列存在較高的同源性。采用MEGA6軟件將HD20編碼的蛋白序列與辣椒、番茄和馬鈴薯等9種植物的ATHB-12-like蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與同一茄科植物的親緣關(guān)系最接近；與棉花、棗以及胡楊等親緣關(guān)系比較接近；與擬南芥的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 煙草HD20轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域

圖3 煙草HD20的亞細(xì)胞定位

使用軟件CLUSTALW對HD20與其他植物ATHB-12氨基酸進(jìn)行多序列比對（圖5），發(fā)現(xiàn)HD20與不同物種間ATHB-12-like編碼蛋白在同源異型結(jié)構(gòu)域以及亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域存在較高的保守型，說明在該類轉(zhuǎn)錄因子中這些保守結(jié)構(gòu)域至關(guān)重要，因此進(jìn)化上較保守。

圖4 基于氨基酸序列的HD20轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 HD20保守結(jié)構(gòu)域序列對比

2.3 HD20的表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

構(gòu)建真核表達(dá)載體pSH737-HD，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將HD20轉(zhuǎn)化至擬南芥（圖6），并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS染色，保存陽性植株，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 轉(zhuǎn)HD20擬南芥的組織的石蠟切片分析

通過石蠟切片檢測轉(zhuǎn)HD20擬南芥組織的差異，發(fā)現(xiàn)莖部木質(zhì)部較對照發(fā)達(dá)。結(jié)果（圖7）表明，HD20與擬南芥的纖維分化有關(guān)，推測HD20在擬南芥纖維分化過程中的重要作用。

圖6 HD20的遺傳轉(zhuǎn)化

圖7 轉(zhuǎn)HD20擬南芥石蠟切片

3 討論

煙草HD20與植物激素的表達(dá)調(diào)控相關(guān)，但其在纖維分化中的作用未見報(bào)道。本研究克隆獲得煙草HD20完整編碼區(qū)的cDNA序列，其推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物同源蛋白的氨基酸序列有保守的特異性序列和較高的序列相似性，其中與辣椒ATHB-12-like基因的氨基酸序列同源性最高，達(dá)74%，具有潛在的生物學(xué)意義。結(jié)構(gòu)域是生物大分子體現(xiàn)特異結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的基礎(chǔ)，分析其編碼的蛋白序列發(fā)現(xiàn)其具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和同源異型結(jié)構(gòu)域，由此推斷該蛋白屬于HD-Zip家族。迄今為止，國內(nèi)外對煙草HD的克隆研究較少。Re等［18］在2011年對煙草 NaHD20（HM107874.2）進(jìn)行克隆，獲得基因長度為1 091 bp，與本研究得到HD20序列相似度為96%。煙草HD20的克隆有助于闡明不同HD20的關(guān)系及豐富HD-Zip家族成員。此外，本研究將煙草HD20遺傳轉(zhuǎn)化至擬南芥，石蠟切片結(jié)果顯示，莖部維管束發(fā)生改變，木質(zhì)部較對照更發(fā)達(dá)，表明該基因與維管組織纖維細(xì)胞的分化相關(guān)，推測該基因參與擬南芥纖維組織分化的代謝調(diào)控，在纖維細(xì)胞分化機(jī)制中發(fā)揮調(diào)控作用。因此，轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草中HD20的上調(diào)表達(dá)是轉(zhuǎn)基因煙草莖部維管束增加的直接因素。

維管組織是陸生植物主要的特征結(jié)構(gòu)，為植物向上生長提供機(jī)械支撐，具有運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、水分及信號(hào)分子的作用。維管束由木質(zhì)部、形成層和韌皮部 3種組織組成。Sachs［19］和 Aloni［20］已經(jīng)開創(chuàng)了維管組織分化的生理研究，發(fā)現(xiàn)纖維形成誘導(dǎo)所需的信號(hào)來自幼葉。Zhong等［21］在1999年證明IFL1調(diào)控?cái)M南芥中的間質(zhì)纖維分化，編碼同源二聚體-亮氨酸拉鏈蛋白，HD-Zip蛋白在間質(zhì)細(xì)胞和維管束中表達(dá)，證明HD-Zip蛋白具有調(diào)控植物纖維細(xì)胞分化的作用。Manavella等［22］發(fā)現(xiàn)HD20具有調(diào)節(jié)植物激素產(chǎn)生的功能，尤其是對JA和ET的正調(diào)控，HD20還可對ET的敏感性及SA的積累起負(fù)調(diào)控作用。本研究表明HD20對煙草及擬南芥的維管束組織纖維分化具有調(diào)控作用。因此，推測HD20編碼的HD-Zip蛋白參與植物的生長發(fā)育，對植物激素的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)功能，或者影響植物體內(nèi)與激素相關(guān)的表達(dá)調(diào)控，從而導(dǎo)致纖維細(xì)胞發(fā)生改變。

為了更加明確地驗(yàn)證HD20與植物體內(nèi)纖維分化的調(diào)控有關(guān)，后續(xù)可將轉(zhuǎn)HD20擬南芥進(jìn)行激素測定以及研究其是否在內(nèi)分泌或維管束狀纖維具有差異表達(dá)，進(jìn)一步為HD-Zip蛋白在纖維分化的調(diào)控提供直接證據(jù)，為HD20的功能研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

克隆獲得HD20的cDNA序列，其蛋白序列具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和同源異型結(jié)構(gòu)域，推測屬于HD-Zip家族。HD20對煙草及擬南芥的維管束組織纖維分化具有調(diào)控作用。

［1］Johannesson H, Wang Y, Engstr?m P. DNA-binding and dimerization preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription factors in vitro［J］. Plant Molecular Biology, 2001, 45（1）：63-73.

［2］Baima S, Possenti M, Matteucci A, et al. The Arabidopsis ATHB-8 HD-Zip protein acts as a differentiation-promoting transcription factor of the vascular meristems［J］. Plant Physiology, 2001, 126（2）：643-655.

［3］Ariel FD, Manavella PA, Dezar CA, et al. The true story of the HDZip family［J］. Trends in Plant Science, 2007, 12（9）：419-426.

［4］Harris JC, Hrmova M, Lopato S, et al. Modulation of plant growth by HD-Zip class I and II transcription factors in response to environmental stimuli［J］. New Phytology, 2011, 190（4）：823-837.

［5］單淳敏. 棉纖維伸長的關(guān)鍵調(diào)控因子GhHOX3的研究［D］.北京：中國科學(xué)院大學(xué), 2014.

［6］M. 阿拉姆, M. S. 伊斯拉姆, B. 艾哈邁德, 等. 編碼來自長蒴黃麻和圓果種黃麻的同源框-亮氨酸拉鏈蛋白hat22（hd-zip蛋白22）的核苷酸序列和使用方法：中國, 105143247 A［P］.2015-12-09.

［7］Du J, Miura E, Robischon M, et al. The populus class III HD ZIP transcription factor, POPCORONA, affects cell differentiation during secondary growth of woody stems［J］. PLoS One, 2011, 6（2）：e17458.

［8］Meijer AH, Kam RJD, D’Erfurth I, et al. HD-Zip proteins of families I and II from rice：interactions and functional properties［J］. Molecular Genetics and Genomics, 2000, 263（1）：12-21.

［9］秦永芳, 李登弟, 李學(xué)寶. 植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2009, 31（4）：514-520.

［10］Zhong R, Taylor JJ, Ye ZH. Transformation of the collateral vascular bundles into amphivasal vascular bundles in an Arabidopsis mutant［J］. Plant Physiology, 1999, 120（1）：53-64.

［11］王瑞, 魯麗麗, 劉拓, 等. 棉花中HD-Zip Ⅳ家族基因的全基因組鑒定及特征分析［J］. 分子植物育種, 2017, 15（8）：2921-2936.

［12］Raud B, Chan RL, Baldwin IT, et al. RNAi-mediated silencing of the HD-Zip gene HD20 in Nicotiana attenuata affects benzyl acetone emission from corollas via ABA levels and the expression of metabolic genes［J］. BMC Plant Biol, 2012, 12（1）：60-75.

［13］吳擁軍, 趙德剛, 許文釗, 等. 轉(zhuǎn)ChIFN-γ基因煙草抗蟲作用初步研究［J］. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2009, 31（6）：629-631.

［14］Wu YJ, Wu YJ, Luo X, et al. Identification of differentially expressed genes that potentially confer pest resistance in transgenic ChIFN-?3 tobacco［J］. Gene, 2014, 543（2）：181-189.

［15］Li D, Ren W, Wang X, et al. A modified method using TRIzol?,reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas［J］. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2009, 158（2）：253-261.

［16］徐錦濤. 八棱海棠actin基因的克隆與GO基因轉(zhuǎn)化擬南芥研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

［17］蔡雁峰. 擬南芥/柴胡高度不對稱體細(xì)胞雜種的研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué), 2007.

［18］Ré DA, Dezar CA, Chan RL, et al. Nicotiana attenuata NaHD20 plays a role in leaf ABA accumulation during water stress,benzylacetone emission from flowers, and the timing of bolting and flower transitions［J］. J Exp Bot, 2011, 62（1）：155-166.

［19］Sachs T. The induction of fibre differentiation in peas［J］. Annals of Botany, 1972, 36（144）：189-197.

［20］Aloni R. Polarity of induction and pattern of primary phloem fiber differentiation in coleus［J］. American Journal of Botany, 1976,63（6）：877-889.

［21］Zhong R, Ye ZH. Alteration of auxin polar transport in the Arabidopsis ifl1 mutants［J］. Plant Physiology, 2001, 126（2）：549-563.

［22］Manavella PA, Dezar CA, Bonaventure G, et al. HAHB4, a sunflower HD-Zip protein, integrates signals from the jasmonic acid and ethylene pathways during wounding and biotic stress responses［J］. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2008,56（3）：376-388.