孫桂婷 陳紅云 趙玲超 胡曉珂 陳營(yíng)

（1. 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264000；2. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，煙臺(tái) 264000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)校區(qū)，煙臺(tái) 264000）

多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）是國(guó)際上廣受關(guān)注的12種持久性有機(jī)污染物之一，因具有耐酸堿性、耐熱性、電絕緣性等特點(diǎn)，曾作為阻燃劑、熱載體、絕緣油等被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中［1］。據(jù)估計(jì)，全球多氯聯(lián)苯總產(chǎn)量約 1.3×106t［2］，而我國(guó)多氯聯(lián)苯總產(chǎn)量約 1.0×104t［3］。PCBs的難降解性、生物富集性、高毒性等環(huán)境特性使其易在環(huán)境和生物體內(nèi)富集，對(duì)環(huán)境和人類的健康產(chǎn)生危害［4-5］，對(duì)PCBs的降解是當(dāng)前亟待解決的環(huán)境問(wèn)題。人類在河海交匯處活動(dòng)頻繁，近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)我國(guó)河流入?？诤徒Ｋ騊CBs污染狀況的研究中均表明，調(diào)查中所涉及的近海海域水體都受到不同程度的PCBs污染［6-9］，王泰等［10］指出渤海灣已經(jīng)受到PCBs的污染。

在我們所了解的范圍內(nèi)，已報(bào)道的PCBs降解菌株大多都是從陸地土壤環(huán)境篩選得到的，未發(fā)現(xiàn)從河海交匯處篩選得到的降解菌株。主要的好氧降解菌如伯克霍爾德氏菌（Burkholderia xenovorans）LB400、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes eutrophus）H850、紅球菌（Rhodococcus sp.）RHA1、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp.）JB1等可以有氧降解五氯及五氯以上PCBs，底物譜范圍寬廣，但絕大多數(shù)的菌株僅局限于降解低氯取代PCBs，且底物譜范圍較窄［11］。在聯(lián)苯降解途徑中，主要的降解產(chǎn)物是氯代苯甲酸，大部分降解菌不能繼續(xù)利用氯代苯甲酸，只能依靠存在于被污染土壤中的其他好氧菌通過(guò)不同的途徑降解［1］。但少數(shù)菌株如木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）IR08、 紅 球 菌（Rhodococcus sp.）RHA1等可以繼續(xù)利用氯代苯甲酸為碳源生存，并且目前也發(fā)現(xiàn)某些降解菌如假單胞菌（Pseudomonas putida）PRS2000等可以利用一氯聯(lián)苯為唯一碳源和能源，并能將一氯聯(lián)將其完全礦化［12-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)從河海交匯處篩選多氯聯(lián)苯降解菌，研究其降解特性和底物譜寬度，以期為生物修復(fù)PCBs污染土壤提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集 采樣地點(diǎn)為山東煙臺(tái)逛蕩河入?？谔帲∟：37.47°，E：121.47°），采集河海交匯處表層 0-15 cm的土樣。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 富集培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基［15］或加入實(shí)驗(yàn)要求所需相應(yīng)碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基［16］。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，加去離子水定容至1 000 mL，pH7.0。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加2%瓊脂。

MM30 液 體 培 養(yǎng) 基：（1）（NH4）2SO41 g、KH2PO43 g、Na2HPO46 g、微量金屬鹽溶液0.5 mL、聯(lián)苯200 mg/L，加去離子水定容至1 000 mL，pH 7.1。（2）Mixture 44 ：Na2B4O7·10H2O 17.7 mg、CuSO4·5H2O 39.2 mg、CaCl2·6H2O 20.1 mg、ZnSO4·7H2O 1 095 mg、EDTA 250 mg， 加 去 離子水定容至 100 mL。加入 100-150 μL 濃 H2SO4，防止產(chǎn)生沉淀。（3）微量金屬鹽溶液：EDTA 0.5 g、CaCO31 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 10 g、MnSO4·H2O 10 g、Mixture 44 10 mL，加去離子水定容至100 mL。

MM30固體培養(yǎng)基：MM30液體培養(yǎng)基加2%瓊脂。

以上培養(yǎng)基（不含聯(lián)苯）均于121℃、0.1 MPa下滅菌20 min后使用。

1.2.2 降解菌的篩選 稱取5 g土壤樣品加入含200mg/L聯(lián)苯的MM30液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d。取100 μL菌液連續(xù)梯度稀釋并均勻涂布于含有200 mg/L聯(lián)苯的MM30固體培養(yǎng)基。選取不同形態(tài)的菌株在含有PCB3的MM30液體培養(yǎng)基中繼續(xù)純化培養(yǎng)獲得單一菌株，將該菌株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后取0.75 mL加入等量30%的甘油中，-80℃凍存。

1.2.3 多氯聯(lián)苯降解菌的鑒定

1.2.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用Solarbio革蘭氏染色試劑盒進(jìn)行革蘭氏染色，并在Leica DM5000B顯微鏡下觀察細(xì)胞染色狀態(tài)。菌液經(jīng)戊二醛固定乙醇脫水和冷凍干燥后，進(jìn)行電鏡掃描。

1.2.3.2 菌種鑒定 MoBio試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并用16S rRNA的通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后委托上海英濰捷基商貿(mào)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已收錄的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)行細(xì)菌的種屬鑒定。利用MEGA5.1軟件的Neighbor-Joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 影響降解菌生長(zhǎng)的不同因素分析

1.2.4.1 pH對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響 取-80℃凍存的P-6-5菌株接入含15 mg/L聯(lián)苯的MM30液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h。無(wú)菌條件下制備休眠細(xì)胞，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大量細(xì)胞，7 000 r/min離心10min，棄上清，菌泥用MM30清洗兩次，重懸菌液至OD600nm約為1.0。按10%接種量轉(zhuǎn)接到pH分別為4、5、6、7、8、9，且含有30 mg/L聯(lián)苯的MM30液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔適當(dāng)時(shí)間用PerkinElmer Lambda 365分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm處吸光度值。

1.2.4.2 鹽度對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響 休眠細(xì)胞制備方法同1.2.4.1，按10%接種量轉(zhuǎn)接到鹽度分別為0、5、20、35、50和65 g/L且含有30 mg/L聯(lián)苯的MM30培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。測(cè)定方法同上。

1.2.4.3 不同誘導(dǎo)劑對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響 取-80℃凍存的P-6-5菌株分別接入含有25 g/L的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，含15 mg/L聯(lián)苯或5 mg/L PCB3的MM30液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h。休眠細(xì)胞制備方法同1.2.4.1，按10%接種量將經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的菌液轉(zhuǎn)接到含5 mg/L PCB3的MM30液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。測(cè)定方法同上。

1.2.5 菌株降解PCB3的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 菌株對(duì)相同初始濃度PCB3的降解 向MM30培養(yǎng)基中加入適量PCB3溶液，使其濃度為10 mg/L，以PCB208為內(nèi)標(biāo)。將OD600nm=1.0的重懸休眠細(xì)胞按10%接種量接入含有上述PCB3和PCB208混合物的MM30培養(yǎng)基中。于30℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)8、16、24、36、48、72 h后，用已除水的正己烷萃取3次，將萃取液用氮?dú)獯抵?00 μL后，利用氣相色譜儀（GC-uECD）檢測(cè)PCB3的殘留量，計(jì)算得出降解菌對(duì)PCB3的降解率。

1.2.5.2 菌株對(duì)不同初始濃度PCB3的降解 取適量PCB3溶液加入MM30培養(yǎng)基中，使降解體系中PCB3的終濃度為10、25、50、75和100 mg/L，以PCB208為內(nèi)標(biāo)。接種方法、萃取方法同1.2.5.1，取樣時(shí)間為48 h。同時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定該菌株生長(zhǎng)量（OD600nm表示）。

1.2.6 對(duì)氯苯甲酸（4-CBA）的檢測(cè)

1.2.6.1 4-CBA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè) 取適量4-CBA標(biāo)準(zhǔn)品固體溶于丙酮中，使其終濃度為10 mg/L，N2吹干后加入 50 μL 衍生化試劑 BSTFA-TMCS 99∶1，73℃孵育30 min，轉(zhuǎn)移到內(nèi)襯管中GC-uECD上樣檢測(cè)4-CBA的含量及出峰時(shí)間。

1.2.6.2 降解產(chǎn)物中4-CBA的檢測(cè) 用已除水的乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系，萃取方法、衍生化方法同上，轉(zhuǎn)移到內(nèi)襯管后GC-uECD上樣檢測(cè)。

1.2.7 氣相色譜分析條件 多氯聯(lián)苯的分析采用HP7890A氣相色譜儀，檢測(cè)器為uECD。色譜 柱 為 SPB-5（30 m×0.2 mm×0.2 μm）（Sigma-Aldrich Biotechnology LP）。載氣為高純氮?dú)?。進(jìn)樣口溫度為250℃，進(jìn)樣體積為1 μL，無(wú)分流進(jìn)樣。柱箱升溫程序如下：初始溫度為100℃，保持2 min，以15℃/min升至200℃后，以10℃/min升至300℃［17］。具體實(shí)驗(yàn)操作參照Barriault等的實(shí)驗(yàn)規(guī)范［18］。

1.2.8 菌株對(duì)mix13的降解 將mix13溶于丙酮，每種多氯聯(lián)苯的終濃度見(jiàn)表1。取OD600nm=1.0的休眠細(xì)胞按5%接種量接入含有mix13的MM30培養(yǎng)基中。30℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h后測(cè)定降解率。萃取方法和氣相色譜儀（GC-uECD）檢測(cè)方法同1.2.5.1和1.2.7。

表1 mix13各組分及終濃度

2 結(jié)果

2.1 多氯聯(lián)苯降解菌的篩選與鑒定

從含聯(lián)苯的土樣中篩選得到一株多氯聯(lián)苯降解菌P-6-5，在含聯(lián)苯的MM30 固體平板上，降解菌的菌落較小呈圓形，微黃色，半透明，邊緣整齊，表面光滑。電鏡掃描菌株形態(tài)如下圖1-A，革蘭氏染色結(jié)果顯示如圖1-B。16S rRNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與多種假單胞菌有著高度相似性，菌株P(guān)-6-5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如下圖2，可以判斷菌株P(guān)-6-5屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

圖1 降解菌P-6-5的電鏡掃描圖（×100k）（A）和革蘭氏染色圖（B）

2.2 pH、鹽度對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響

pH和鹽度對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響作用明顯，如圖3，降解菌在pH6-8范圍內(nèi)都可以生存，在過(guò)酸或過(guò)堿環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制。同樣，在一定范圍內(nèi)，鹽度的增加促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，在pH7，鹽度35時(shí)是降解菌的最佳生長(zhǎng)條件。

2.3 誘導(dǎo)劑對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響

菌株經(jīng)誘導(dǎo)和培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到以PCB3為唯一碳源的MM30培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖4所示，誘導(dǎo)劑不同，微生物生長(zhǎng)情況不同。經(jīng)過(guò)LB培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到以PCB3為唯一碳源的MM30培養(yǎng)基中的生物量逐漸降低，與之相比，經(jīng)過(guò)BPH和PCB3誘導(dǎo)的降解菌在轉(zhuǎn)接到PCB3后都可以繼續(xù)維持菌株的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在生長(zhǎng)后期，由于碳源的消耗不足以維持大量細(xì)胞的生長(zhǎng)，降解菌的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，微生物的生物量逐漸下降。

圖2 鄰接法構(gòu)建菌株P(guān)-6-5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 菌株P(guān)-6-5在不同pH和不同鹽度中的生長(zhǎng)情況

2.4 菌株降解PCB3的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 降解菌對(duì)PCB3的降解 降解菌對(duì)PCB3的降解量及殘留率隨時(shí)間變化曲線如圖5所示，PCB3的降解量隨時(shí)間的增加而增加，殘留率隨時(shí)間的增加而減小，且降解量曲線在降解初期增加較快，48 h后增加幅度趨緩，72 h基本到達(dá)降解菌的最大降解率（95.3%）。

2.4.2 PCB3的不同初始濃度對(duì)降解的影響 從圖6中可以看出，P-6-5對(duì)不同濃度PCB3的降解能力不同，隨著濃度的增加，PCB3的殘留率升高，與之對(duì)應(yīng)的降解菌的吸光度值逐漸下降。在底物濃度為10 mg/L時(shí)，底物的殘留率僅為9.4%，此時(shí)具有最大吸光度值和最大降解速率1.9 mg/（L·h）。如圖7，底物濃度的增加可以促進(jìn)降解菌對(duì)底物的降解能力，而繼續(xù)增加底物濃度，PCB3的降解量逐漸下降，降解菌的生長(zhǎng)能力降低。

圖4 不同誘導(dǎo)劑對(duì)降解菌生長(zhǎng)情況的影響

圖5 菌株P(guān)-6-5的殘留率曲線和降解量曲線

圖6 PCB3初始濃度對(duì)降解的影響

圖7 菌株P(guān)-6-5對(duì)不同初始濃度PCB3的降解量

2.5 降解產(chǎn)物的檢測(cè)與分析

如圖8、9，PCB3及4-CBA標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間分別為10.90 min和8.85 min，實(shí)驗(yàn)組的出峰時(shí)間如圖10，很明顯的出現(xiàn)許多雜峰，并且含有PCB3和4-CBA的出峰時(shí)間。

圖8 GC-uECD檢測(cè)PCB3標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間

圖9 衍生化4-CBA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)GC-uECD檢測(cè)的出峰時(shí)間

2.6 降解菌對(duì)mix13的降解

如表2所示，P-6-5對(duì)二氯、三氯、四氯聯(lián)苯都存在降解，總體遵循氯取代數(shù)量增多，降解率降低的規(guī)律。菌株P(guān)-6-5的底物適應(yīng)范圍可以涵蓋至四氯聯(lián)苯，底物譜范圍較寬。

圖10 PCB3代謝產(chǎn)物經(jīng)TMS衍生化后的GC-uECD檢測(cè)總離子色譜圖

表2 菌株P(guān)-6-5對(duì)mix13的降解率

3 討論

每種微生物的生長(zhǎng)都有其最適pH和鹽度，pH和鹽度的改變會(huì)影響酶的活性，進(jìn)而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)造成蛋白變性，細(xì)胞膜損壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，影響微生物的生長(zhǎng)速率［19-20］。結(jié)合菌株從河海交匯處篩選得到，海水的平均鹽度為35，pH值范圍7.86-8.30［21］，而在pH7-8，鹽度35時(shí)，降解菌P-6-5生長(zhǎng)狀況良好，可以判斷P-6-5具備海水菌的特點(diǎn)，這也為海洋PCBs污染修復(fù)提供良好開(kāi)端。

聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯被認(rèn)為是有助于PCBs生物降解的誘導(dǎo)劑，以BPH和PCB3為碳源的誘導(dǎo)對(duì)多氯聯(lián)苯降解菌的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。低濃度時(shí)底物的生物毒性效應(yīng)不明顯，底物降解率低，而隨著底物濃度的增加可以提高底物被微生物利用的幾率，降解相關(guān)的酶與底物結(jié)合能力增強(qiáng)，酶促反應(yīng)效率提高，底物降解量提高。而濃度的提高對(duì)降解菌生物代謝能力的促進(jìn)作用有限，濃度過(guò)高反而會(huì)因高濃度底物的毒害作用抑制降解菌的生長(zhǎng)以及酶與底物結(jié)合能力［22］，影響降解菌對(duì)底物的轉(zhuǎn)化。但菌株P(guān)-6-5在高濃度的底物環(huán)境中（75 mg/L、100 mg/L），仍具有17%、9.8%的降解率和63.75 μg、49 μg的降解量，說(shuō)明P-6-5能夠適應(yīng)高濃度PCB3的毒性環(huán)境，具有降解高濃度PCBs的潛能。

產(chǎn)物的鑒定是推測(cè)代謝途徑的重要證據(jù)，聯(lián)苯降解途徑是微生物參與PCBs降解的主要途徑，其主要代謝產(chǎn)物為氯代苯甲酸和4-羥基戊酸［23-24］，大多PCBs降解菌不能繼續(xù)礦化氯代苯甲酸，需要其他可降解氯代苯甲酸的好氧菌協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)完全礦化［25］。對(duì)菌株P(guān)-6-5的降解產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組不僅出現(xiàn)4-CBA的出峰時(shí)間，還有許多雜峰，說(shuō)明PCB3的降解產(chǎn)物中有4-CBA，更可能是降解菌可以利用4-CBA為碳源生存，產(chǎn)物中出現(xiàn)4-CBA的代謝產(chǎn)物，這為降解菌能夠完全礦化PCB3提供有力證據(jù)，也推測(cè)了菌株P(guān)-6-5的降解途徑可能不同于聯(lián)苯降解途徑。

Hickey、Nováková和 Tandlich 等［26-28］研 究 者認(rèn)為假單胞菌是最有效的多氯聯(lián)苯降解菌，多項(xiàng)研究表明，有氧條件下，低氯取代同系物較高氯取代同系物更易發(fā)生降解［29-31］。根據(jù)氯取代位置的不同，具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)的多氯聯(lián)苯降解反應(yīng)活性低于非對(duì)稱結(jié)構(gòu)多氯聯(lián)苯，不同位置氯取代PCBs降解反應(yīng)活性大小順序?yàn)椋亨徫唬鹃g位＞對(duì)位［32］。在本實(shí)驗(yàn)中，菌株P(guān)-6-5的降解并不完全符合上述降解規(guī)律，對(duì)于最難降解的對(duì)位多氯聯(lián)苯降解率更高，降解更傾向于對(duì)位脫氯，可能存在不同的降解途徑。降解菌對(duì)毒性較大的對(duì)稱型共平面多氯聯(lián)苯，如 2，2’，4，4’-四氯聯(lián)苯，2，2’，5，5′-四氯聯(lián)苯，2，2’，6，6’-四氯聯(lián)苯都存在降解，說(shuō)明 P-6-5能適應(yīng)毒性較高的多氯聯(lián)苯環(huán)境，對(duì)鄰、間、對(duì)位多氯聯(lián)苯均有降解，具有一定降解潛能和研究前景。與其他大部分有氧降解菌類似，對(duì)于五氯以上高氯聯(lián)苯，P-6-5需要厭氧脫氯和好氧降解共同作用。

4 結(jié)論

從河海交匯處土樣中篩選得到一株多氯聯(lián)苯降解菌P-6-5，16S rRNA鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其最適生長(zhǎng)條件為pH7，鹽度35。降解菌對(duì)10-100 mg/L底物具有轉(zhuǎn)化能力，10 mg/L時(shí)具有最大降解速率（1.9 mg/（L·h））和最大降解率（95.3%）。對(duì)于毒性較大的 2，2’，4，4’-四氯聯(lián)苯，2，2’，5，5’-四氯聯(lián)苯，2，2’，6，6’-四氯聯(lián)苯等對(duì)稱型共平面PCBs表現(xiàn)出明顯的降解效果。結(jié)合產(chǎn)物分析，推測(cè)降解菌P-6-5可能存在不同的降解途徑，對(duì)環(huán)境中PCBs的生物修復(fù)具有重要意義。

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