張夢恬 裴娟 李國 趙輝 陳建權(quán) 祝建波 王愛英

（石河子大學生命科學學院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室 石河子 832003）

棉花是世界上重要的纖維作物，由于新疆獨特的自然氣候使其成為國內(nèi)面積最大的產(chǎn)棉區(qū)。棉花黃萎病是全球范圍內(nèi)的棉花病害之一，極大影響棉花質(zhì)量及產(chǎn)量。棉花黃萎病是由輪枝菌屬（Verticillium）的病原菌引起，目前發(fā)現(xiàn)有6個種是植物病原菌，分別為大麗輪枝菌（V . dahliae Klebahn）、變黑輪枝菌（V.nigrescens Pethybridge）、三體輪枝菌（V.tricorpus Isaac）、黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum Reinke and Berthold）、 云狀輪枝菌（V.nubilum Pethybridge）及V.theobromae（Turconi）［1-4］。其中造成棉花黃萎病的主要病原菌為大麗輪枝菌和黑白輪枝菌。由于植棉地區(qū)生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，造成病菌表現(xiàn)出不同的致病類型，從而產(chǎn)生許多致病力強的菌株類型，但是變異形成的菌株類型仍然不是太清楚。姚耀文等［5］通過致病力測定將我國棉花黃萎病分為3個生理型，分別為：生理型Ⅰ致病力極強，生理型Ⅱ致病力極弱，以及致病力中等介于前兩種生理型之間的生理型Ⅲ。段維軍等［6］證實新疆存在少量落葉型黃萎菌。韓宏偉等［7］通過分子手段發(fā)現(xiàn)新疆北部（北疆）落葉型黃萎菌比例占到39%。李彩紅等［8］發(fā)現(xiàn)氣候條件的改變會影響黃萎病菌產(chǎn)生遺傳變異及致病類型差異。劉燕霞等［9］利用ISSR標記技術(shù)對不同地區(qū)大麗輪枝菌遺傳分化及致病力進行分析。黃萎病菌菌株間的親緣關(guān)系可以利用分子進化樹及營養(yǎng)親和性技術(shù)來分析。Puhalla等［10］首次利用硝酸鹽營養(yǎng)缺陷性突變體（nit）技術(shù)研究黃萎病菌營養(yǎng)親和性。本研究通過現(xiàn)代分子技術(shù)檢測和菌株培養(yǎng)表型觀察相結(jié)合的方法研究新疆石河子地區(qū)棉花黃萎病菌的致病類型及菌株的親緣關(guān)系，從而明確石河子地區(qū)棉花黃萎病菌的變異和致病力分化情況，以期為該地區(qū)篩選黃萎病的耐病或抗病棉花品種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 棉花病株采自新疆石河子棉花種植區(qū)，其中SHZ-1至SHZ-9采自143團石南農(nóng)場，SHZ-10至SHZ-16采自145團清泉集七連，SHZ-17至SHZ-24采自大學試驗場二連。pMD19-T克隆載體、PCR反應(yīng)液購自TaKaRa公司，瓊脂糖購自Biowest公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生物公司，引物合成由北京華大基因有限公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基Czapek液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基［11］用于真菌及細菌培養(yǎng)；BM培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基、KPS培養(yǎng)基、MO2培養(yǎng)基及MH培養(yǎng)基［12-13］均用于營養(yǎng)親和性研究。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 通過岳永亮等［14］的方法對本研究中感病棉株進行組織分離。分離純化后菌株低溫保存。

1.2.2 分子生物學檢測 通過優(yōu)化的CTAB法［15］提取棉花黃萎菌DNA。以其為模板，通過真菌ITS通用引物［16］ITS1/ITS4、黃萎菌特異引物 DB19/DB22、黃萎菌致病類型特異引物［17］D-1/D-2、ND-1/ND-2分別對分離菌株進行PCR擴增（表1）。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，Taq聚合酶0.5 μL、Taq酶緩沖液 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、引物 1.0 μL、模板 1.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃ 45 s、56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃，10 min。真菌ITS通用引物擴增后獲得的陽性克隆，連接至pMD19-T載體，測序連接成功后的質(zhì)粒，比對測序結(jié)果，下載比對后同源性較高的ITS序列，利用MEGA 5.0采用Neighbour-Joining Method構(gòu)建病原菌株分子進化樹。

表1 黃萎病菌PCR引物

1.2.3 菌株營養(yǎng)親和性鑒定 通過景嵐等［18］的方法對本研究中分離得到的24株棉花黃萎病菌進行營養(yǎng)親和性鑒定分析

1.2.4 菌株溫室致病力鑒定 采用無底營養(yǎng)缽定量接菌液法［19-20］，接菌孢子濃度為 1.0×107cef/mL。供試棉株為新陸早 33號、新陸早7號、中棉35號。將單孢純化后的菌株利用Czapek液體培養(yǎng)基，26℃、180 r/min避光振蕩培養(yǎng)一周，四層紗布過濾菌絲，接種于長至3片真葉的棉苗，接種15 d后，根據(jù)感病棉苗的病情指數(shù)進行黃萎菌致病力分析。

黃萎病病級調(diào)查［19-20］：0級：健株，無病狀；1級：子葉出現(xiàn)病狀；2級：1片真葉嚴重發(fā)??；3級：2片真葉表現(xiàn)病狀；4級：植株生長點死亡或全株枯死；病情指數(shù)計算公式如下：

致病力類型的劃分：強致病力為I型：平均病指30.0以上；中致病型III型：平均病指20.1-30.0；弱致病型II型：平均病指20.0以下。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)鑒定

本研究分離的24株菌株菌落形態(tài)，與孔德真［21］等描述相似，菌落表面為白色絨毛狀，周圍有黑色微菌核產(chǎn)生，菌落形態(tài)以圓形居多，少部分為橢圓形，進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生與大麗輪枝菌相似的含有2-4個分枝的輪狀分生孢子梗（圖1-A）；還能夠產(chǎn)生與大麗輪枝菌相似的黑色微菌核結(jié)構(gòu)（圖1-B），在微菌核旁側(cè)有少量無色透明孢子（圖1-C）。大部分分離菌株菌落都有同心輪紋（圖2-A），部分菌落微菌核呈現(xiàn)出由內(nèi)向外放射狀（圖2-B），綜上所述，初步判定分離菌株為棉花黃萎菌。依據(jù)菌落不同形態(tài)將供試菌株分為3種。菌核型（圖2-C）：培養(yǎng)基中央菌核較多，邊緣菌核較少，菌絲菌核周圍形成白色圓圈，氣生菌絲不發(fā)達，無凸起。絲核型（圖2-D）：產(chǎn)生較多菌核，呈現(xiàn)發(fā)散狀態(tài)，邊緣整齊，培養(yǎng)基中央有較多氣生菌絲，有灰白色菌絲凸起。菌絲型（圖2-E）：不產(chǎn)生菌核，菌絲密集且邊緣整齊，無凸起，氣生菌絲不發(fā)達。

2.2 供試菌株分子檢測

供試菌株ITS區(qū)段通過真菌特異引物 ITS1 和ITS4 進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到約 500 bp的目的條帶（圖3-A）。測序后，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)這些序列和已知ITS 序列具有高度同源性，從分子水平鑒定證明供試菌株為大麗輪枝菌。利用PCR手段通過黃萎菌特異性引物DB19/DB22對純化的菌株進行擴增得到 539 bp 的特異性條帶（圖3-B），從而進一步確定分離得到的菌株為大麗輪枝菌。對供試的棉花黃萎病菌采用落葉型（D-1/D-2）和非落葉型特異引物（ND-1/ND-2）進行聚合酶鏈式反應(yīng)，落葉性引物擴增可得到約500 bp的目的條帶，非落葉型引物擴增可得到約1 500 bp的目的條帶（圖3-C）。確定分離得到的黃萎菌11株為落葉型，13株為非落葉型。

圖1 分離菌株的分生孢子、孢子梗及微菌核的顯微形態(tài)

圖2 分離菌株的微菌核形態(tài)及菌落培養(yǎng)類型

2.3 序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將分離的24株菌株ITS序列與GenBank中同源性較高的輪枝菌 ITS 序列進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。這些ITS序列信息如下：KC156638.1、U82452.1、KC156640.1、KJ696553.1、KC156635.1、KM013462.1 分別來自于中國北京、美國麥迪遜、中國河南、北京、河南及重慶；分離的24株黃萎菌中SHZ-4、SHZ-5、SHZ-6、SHZ-8、SHZ-9、SHZ-11在同一進化支，與來自北京的KJ696553.1相近；SHZ-24與來自河南KCl156635.1在同一進化支比較相近；SHZ-17、SHZ-23在同一進化支上，與進化上來自美國的U82452.1和來自中國河南的KCl156640.1比較相近。

圖3 分離菌株ITS及特異性的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.4 分離菌株的營養(yǎng)親和鑒定

通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，分離菌株中有10株菌株可產(chǎn)生突變體菌落，菌落邊緣呈現(xiàn)擴散性生長扇形突變體菌落。而其中14株不能產(chǎn)生突變體。24株菌株共獲得53個突變體，nit1、nitM、nit3的數(shù)值分別為39、10、4，分別占總突變體的73.58%、18.87%及7.54%。nit1突變體數(shù)量最多，最易獲得；nitM次之；nit3突變體最難獲得。對分離得到的24株黃萎菌的nit1和nitM突變體進行全組合配對，研究菌株之間的親和性。結(jié)果（表2）表明：供試菌株可分為3個不同的營養(yǎng)親和群，其中SHZ-4、SHZ-5、SHZ-6、SHZ-8、SHZ-9、SHZ-11 屬于一個親和群，命名為VCG1。SHZ-2、SHZ-18屬于一個親和群，命名為VCG2。SHZ-13、SHZ-21屬于一個親和群，命名為VCG3。

2.5 黃萎病菌致病力測定

利用無底營養(yǎng)缽定量接菌液法測定24株黃萎菌在3個不同的鑒別寄主上的致病力，結(jié)果顯示（表3）24株菌株表現(xiàn)出明顯的致病力差異。根據(jù)致病力不同將24株菌株劃分為強、中、弱3種不同類型。強致病力占75%，中等致病力占8.3%，弱致病力占16.7%。其中SHZ-9菌株的致病力較強，SHZ-4號菌株的致病力較弱。

圖4 分離的24株石河子棉花棉花黃萎病菌ITS序列構(gòu)建的N-J進化樹

表2 分離菌株得到Nit突變體的數(shù)目及其營養(yǎng)親和群

表3 24個不同供試病株對3個棉花品種的致病性差異鑒定

3 討論

棉花黃萎病菌本身變異情況及致病力分化研究可為培育優(yōu)良抗病品種及有效的病害預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。棉花黃萎病多是由大麗輪枝菌造成的土傳病害，特點是分布廣、變異性強、造成危害大。李國英等［22］研究表明石河子地區(qū)于2001-2008年間，黃萎病發(fā)病面積成倍增加，發(fā)病率高于30%的發(fā)病面積更是增加8倍以上。韓宏偉［7］等研究表明2005-2010年間新疆北部棉花黃萎菌由以中、弱致病力為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐詮娭虏×橹鳌１狙芯繌氖幼硬煌貐^(qū)自然病圃采集感病植株，經(jīng)組織分離、分子鑒定后獲得24株大麗輪枝菌，其中強、中致病力類型菌株有20株，占到83.3%，說明石河子棉區(qū)黃萎菌以強、中致病力為主，同時本研究中強致病力菌株占到75%，這與韓宏偉等研究結(jié)果中石河子地區(qū)強致病力菌系占51.7%相比高出了23.3%，由此說明，石河子棉區(qū)黃萎病情明顯加重、枯死型癥狀增多的主要原因是石河子地區(qū)黃萎菌群體致病力類型發(fā)生較大變化，致病力強菌系明顯增加。

2004年，研究表明新疆僅有少量落葉型黃萎菌存在；2008年，新疆北部落葉型黃萎菌達到39%［7］；2009年新疆石河子地區(qū)落葉型黃萎菌已達到37.9%［23］。本研究分離所獲24株菌株中，落葉型黃萎菌11株，占到45.8%，這與2009年相比高出了6.8%。同時11株落葉型黃萎菌中強致病力類型9株，占81.8%，由此說明，石河子棉區(qū)在生長的中后期出現(xiàn)大面積落葉致光桿的主要原因是石河子地區(qū)黃萎菌群體出現(xiàn)較多致病性強的落葉型菌系。同時SHZ-9是24株菌株中致病力最強的菌株，但是它是非落葉型菌系，這與王國寧等［24］發(fā)現(xiàn)有些非落葉型黃萎菌致病力強于落葉型黃萎菌相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)SHZ-9與SHZ-4在分子進化樹上親緣關(guān)系較近，且同屬于VCG1，分子檢測后發(fā)現(xiàn)兩者均為非落葉型大麗輪枝菌，但侵染相同品種棉花后表現(xiàn)出的致病力有顯著差異，SHZ-9是24株菌株中致病力最強的菌株，平均病情指數(shù)為50，而SHZ-4是致病力較弱的菌株，平均病情指數(shù)僅為17.6，這表明同為非落葉型菌系接種相同品種能表現(xiàn)出完全不同的致病力，與朱荷琴等［25］研究結(jié)果相似，兩者致病力分化明顯的原因還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究分離獲得24株石河子地區(qū)棉花黃萎病致病菌株均為大麗輪枝菌，11株落葉型黃萎菌，13株非落葉型黃萎菌。分子進化樹顯示24株菌在系統(tǒng)進化方式上屬于2個不同的分支。致病力結(jié)果顯示24株菌株強致病力占到75%，中等致病力占到8.3%，弱致病力占到16.7%，SHZ-9致病力最強，SHZ-4致病力較弱，菌株存在明顯致病力分化現(xiàn)象。

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