石佳 楊丹丹 葛慧雯 杜京堯 梁衛(wèi)紅

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸（Thr/Ser）蛋白激酶，普遍存在于哺乳動(dòng)物、高等植物和真菌等高等真核生物體內(nèi)［1］。MAPK的結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化中都是高度保守的。由MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化以及多種脅迫應(yīng)答過(guò)程，并且MAPK還涉及激素介導(dǎo)的信號(hào)通路［2］。

研究顯示，植物的MAPK家族參與了調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，包括配子形成、胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、衰老、脫落、受精和種子的形成［3］。如MAPK家族可以作為受體樣激酶（Receptor-like kinase，RLKs）的下游信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，其中對(duì)擬南芥AtMPK3和AtMPK6研究較為深入，其能作為RLKs的下游信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞通訊過(guò)程［4-6］。有研究顯示，煙草MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路NPK1-NQK1-NRK1在調(diào)控細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要的作用［7-9］。植物的MAPK還參與逆境脅迫以及激素信號(hào)應(yīng)答。如擬南芥MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，AtMKK1或AtMKK2通過(guò)激活下游的AtMPK4，不僅調(diào)控水楊酸（Salicylic acid，SA）的積累、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的平衡，還對(duì)低溫、高鹽和機(jī)械損傷等非生物脅迫也能作出響應(yīng)［10-12］。

水稻MAPK同樣參與了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫應(yīng)答和非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程，有些MAPK與調(diào)控植物激素信號(hào)通路有關(guān)，如OsMPK6的活性能被白葉枯病菌的侵染所激活，從而引起抗逆植物激素的積累，活化茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和水楊酸信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)抗病基因的表達(dá)量，增強(qiáng)植株局部對(duì)白葉枯病菌的抗性［13-14］。OsMPK5參與水稻對(duì)高鹽、干旱、紫外、臭氧、重金屬、高溫及低溫脅迫等幾乎所有非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程［15-16］；OsMEK1-OsMAP1級(jí)聯(lián)通路則廣泛參與了水稻的低溫脅迫應(yīng)答過(guò)程［17］。盡管許多MAPK參與水稻的生物與非生物脅迫應(yīng)答及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程［2］，但其生物學(xué)功能和作用機(jī)制仍有待深入研究。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)水稻MAPK家族成員OsMPK14的研究顯示，該基因參與多種水稻非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程［18］，水稻功能未知基因OsMPK15與其同源性最高。為此，本研究擬克隆OsMPK15的cDNA編碼區(qū)，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)OsMPK15的表達(dá)特性，旨為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻材料為粳稻品種日本晴（Oryza sativa L.

japonica.cv. Nipponbare）?？寺≥d體pEASY-T載體和高純度質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物發(fā)育分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。TRIzol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM、限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物公司；植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、水楊酸、茉莉酸、聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG6000）、氯化鈉（Sodium chloride）、氨芐霉素（Ampicillin）購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的種植及處理 取日本晴水稻種子若干置于小燒杯中，用75%的酒精消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗5-6次，每次沖洗1 min。用無(wú)菌水完全淹沒(méi)種子，浸泡1 h。將種子轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入適量的水（不能完全淹沒(méi)種子），28℃黑暗培養(yǎng)2-3 d。待種子長(zhǎng)出幼芽后，采用人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃、光照強(qiáng)度16 000 lx、光照時(shí)間為16 h/d。將水培生長(zhǎng)15 d的水稻幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。待水稻幼苗適應(yīng)2 d后，分別用含有150 mmol/L NaCl（鹽脅迫）、30% PEG6000（模擬干旱脅迫）、100 μmol/L JA、100 μmol/L SA 和 100 μmol/L ABA的Yoshida培養(yǎng)液［19］處理水稻幼苗，處理方法參照張靜等［20］方法進(jìn)行。分別在處理0、3、6、9、12和24 h后取水稻幼苗的根組織適量，經(jīng)液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 水稻的大田種植及取材 試驗(yàn)田平整、浸泡作為苗床育苗，2014年5月1日將種子分散播種至苗床，加水淹沒(méi)苗床，2014年5月25日進(jìn)行分苗，在水稻生長(zhǎng)至幼穗期取其根、莖、葉、葉鞘、幼穗（生長(zhǎng)至1-2 cm、3-5 cm、5-8 cm）組織，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.3 總RNA的提取和cDNA的合成 采用TRizon法提取上述組織的總RNA，經(jīng)快速電泳，檢測(cè)確認(rèn)后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，制備cDNA。

1.2.4 水稻OsMPK15的cDNA編碼區(qū)的克隆 以上述制備的水稻根組織的cDNA為模板，用根據(jù)水稻OsMPK15編碼框設(shè)計(jì)引物P1/P2，擴(kuò)增OsMPK15的cDNA編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、上下游引物各 0.5 μL、dNTP 2.5 μL、5×Taq buffer 5 μL、Taq酶 0.5 μL，加 ddH2O 至終體積 50 μL；反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 2 min ；95℃ 20 s，53℃ 20 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，采用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶。取3 μL回收產(chǎn)物與pEASY-T載體（含T4連接酶）連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100 μg/mL Ampicillin的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取LB固體培養(yǎng)基的單克隆，接種至5 mL含有100 μg/mL Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，雙酶切鑒定后測(cè)序。將測(cè)序獲得的OsMPK15的cDNA編碼區(qū)提交至 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列分析和同源檢索。采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。引物（表1）均委托蘇州金唯智生物公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 水稻OsMPK15不同組織中的表達(dá)分析 以組成型表達(dá)的OsActin1為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)，以反轉(zhuǎn)錄制備的各個(gè)組織樣品的cDNA為模板，采用P3/P4和P5/P6引物組合分別擴(kuò)增OsMPK15和OsActin1。熒光定量反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各 0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，加 ddH2O 至終體系 20 μL。使用ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR儀（Applied Biosystems）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序95℃30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織進(jìn)行3次重復(fù)，采用2-△△Ct法分析結(jié)果，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel軟件，顯著性分析采用Spass v19.0軟件。

1.2.6 OsMPK15對(duì)非生物脅迫和激素的響應(yīng)分析取經(jīng)過(guò)干旱、高鹽、激素處理的水稻幼苗根組織，以組成型表達(dá)的OsActin1為內(nèi)參基因，進(jìn)行OsMPK15的qRT-PCR分析，操作同1.2.5。

2 結(jié)果

2.1 水稻OsMPK15的cDNA編碼區(qū)的克隆

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，P1/P2為引物，擴(kuò)增得到1條約1 500 bp的特異性片段，與預(yù)期的OsMPK15序列的cDNA編碼區(qū)序列大小符合（圖1-A）。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，與pEASY-T載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取若干單菌落分別擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖1-B）。將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆的OsMPK15序列與文獻(xiàn)推測(cè)的序列［21］一致，OsMPK15的cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)1 497 bp，預(yù)期編碼498個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。

圖1 OsMPK15的cDNA編碼區(qū)的擴(kuò)增和克隆

2.2 水稻OsMPK15的序列分析

將OsMPK15的cDNA編碼區(qū)序列提交至NCBI，分析其編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白在第13-304處的氨基酸對(duì)應(yīng)MAPK特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN軟件，對(duì)水稻MAPK家族E組的3個(gè)成員OsMPK13、OsMPK14和OsMPK15進(jìn)行比對(duì)（圖2），發(fā)現(xiàn)盡管構(gòu)成3種蛋白的氨基酸數(shù)目不同，但是序列同源性很高，尤其是N端序列相似性很高，其序列差異主要體現(xiàn)在C端；且絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，都具有TDY基序。其中OsMPK14和OsMPK15蛋白同源性達(dá)到82.87%。

將OsMPK15蛋白質(zhì)序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST檢索，選擇其中11種同源性較高的，來(lái)自花生、番茄、葡萄、卷柏、小麥、擬南芥、煙草、棉花及苜蓿的MAPK，采用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果（圖3）顯示，與水稻OsMPK15相似性最高的是小麥TaMPK2，同源性高達(dá)79.78%，提示二者可能是同源基因。

圖2 水稻MAPK家族E組3個(gè)成員的氨基酸序列比對(duì)

圖3 基于水稻OsMPK15與其他植物MAPK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 OsMPK15在幼穗期水稻中的表達(dá)特性

以組成型表達(dá)的OsActin1為內(nèi)參基因，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)OsMPK15在幼穗期水稻根、莖、葉、葉鞘以及不同發(fā)育階段幼穗組織中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果（圖4）顯示，OsMPK15在水稻幼穗期所檢測(cè)的各組織中普遍表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。其中在葉和葉鞘中的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，是其他組織中表達(dá)量的4-6倍。

2.4 激素對(duì)OsMPK15在幼苗根中表達(dá)的影響

以JA、SA和ABA分別處理15 d的水稻幼苗，以水稻OsActin1作為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)OsMPK15在3種激素處理后的根中24 h之內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果（圖5）顯示，OsMPK15對(duì)3種激素均有應(yīng)答，在檢測(cè)的24 h內(nèi)，均出現(xiàn)表達(dá)水平上調(diào)，而后恢復(fù)的趨勢(shì)，但是表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同，其中JA處理12 h后其表達(dá)上調(diào)了4倍，SA處理3 h后表達(dá)上調(diào)了4倍，ABA處理9 h后其表達(dá)上調(diào)了7倍，提示該基因?qū)@些激素的敏感度和應(yīng)答模式存在差異。

圖4 OsMPK15在水稻幼穗期各組織中的表達(dá)

2.5 非生物脅迫對(duì)OsMPK15基因表達(dá)的影響

對(duì)水稻幼苗進(jìn)行模擬干旱和高鹽處理，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)該基因在根中24 h之內(nèi)的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在模擬干旱的脅迫下，OsMPK15的表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，在處理的12 h內(nèi)其表達(dá)量維持在0 h的3倍左右，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在高鹽處理?xiàng)l件下，其表達(dá)量也有上調(diào)，在9 h內(nèi)表達(dá)量逐漸上升，達(dá)到2倍后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖6）。結(jié)果表明，干旱和高鹽對(duì)OsMPK15的表達(dá)都有影響，但是相比之下，干旱對(duì)該基因表達(dá)的影響更為顯著。

圖5 JA、SA和ABA激素處理對(duì)OsMPK15基因表達(dá)的影響

圖6 干旱和鹽脅迫對(duì)OsMPK15表達(dá)的影響

3 討論

無(wú)論酵母還是動(dòng)植物的MAPK在進(jìn)化過(guò)程中都高度保守，具有相似的保守結(jié)構(gòu)。與動(dòng)物的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）相似，植物MAPK活性環(huán)上同樣具有TDY或TEY基序［21］。同樣，依據(jù)活性環(huán)上特殊基序TXY的種類(lèi)（TEY/TDY），將水稻MAPK劃分為A-F 7組，本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆的OsMPK15序列與文獻(xiàn)推測(cè)的序列［22］一致，預(yù)期編碼的蛋白包含498個(gè)氨基酸，屬于E組成員。與之同屬E組的OsMPK13已被證實(shí)參與苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTH）誘導(dǎo)的水稻抗病反應(yīng)［23］，OsMPK14在水稻的非生物脅迫與激素應(yīng)答調(diào)控過(guò)程中具有重要作用［22］，但對(duì)OsMPK15的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

不良的土壤條件如干旱、高鹽等是制約水稻產(chǎn)量的主要因素。已有研究顯示，MAPK在植物應(yīng)答多種非生物脅迫的過(guò)程中扮演了重要的角色。例如，在擬南芥中，低溫、高鹽、機(jī)械損傷等可以顯著提高AtMEKK1的轉(zhuǎn)錄水平［24］；低溫、干旱、高滲、創(chuàng)傷等可以激活A(yù)tMPK4和AtMPK6的瞬時(shí)表達(dá)［25］。水 稻 中 OsMPK4、OsMPK5、OsMPK7、OsMPK8和OsMPK12等都可以被干旱、鹽或者溫度的變化而誘導(dǎo)表達(dá)［26-28］。為了研究非生物脅迫對(duì)水稻OsMPK15基因表達(dá)的影響，本研究模擬了干旱和高鹽脅迫，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫下，OsMPK15在根中的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)。相對(duì)于鹽脅迫，OsMPK15對(duì)干旱脅迫更敏感。有報(bào)道顯示，與OsMPK15同源性極高的OsMPK14和小麥TaMPK2均參與了非生物脅迫和激素的應(yīng)答調(diào)控過(guò)程［22］。已有研究顯示，外源ABA影響了多種植物MAPK基因的表達(dá)、蛋白的積累以及酶的活性，MAPK還參與了ABA介導(dǎo)的多種信號(hào)通路，包括氧化防御、保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和種子的萌發(fā)［29-32］。在擬南芥中，JA和SA可以誘導(dǎo)AtMPK6和AtMPK3的表達(dá)［33-34］。本研究發(fā)現(xiàn)，OsMPK15對(duì)激素ABA、JA和SA均有響應(yīng)，其中以ABA誘導(dǎo)OsMPK15表達(dá)上調(diào)幅度最大。鑒于ABA是植物逆境脅迫相關(guān)激素，OsMPK15對(duì)ABA處理產(chǎn)生高度的應(yīng)答反應(yīng)，同樣暗示該基因可能參與了水稻的逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，OsMPK15的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道的OsMPK14基因的表達(dá)模式十分相似，但也存在顯著差異，如OsMPK14的表達(dá)在一定程度上受到干旱脅迫的抑制作用［18］，這些結(jié)果說(shuō)明這兩種水稻MAPK與水稻的非生物脅迫應(yīng)答有密切聯(lián)系。此外，OsMPK15在幼穗期的水稻各組織中在葉和葉鞘中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，OsMPK14在水稻地上部分的表達(dá)受到光的負(fù)調(diào)控［18］，提示它們也可能與水稻的光信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步的深入研究。

本研究結(jié)果提示，水稻OsMPK15可能與水稻的非生物脅迫應(yīng)答、激素信號(hào)通路以及光信號(hào)通路有所關(guān)聯(lián)，但其具體功能尚未見(jiàn)報(bào)道，應(yīng)答機(jī)制也有待研究。目前，實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建了OsMPK15敲除水稻，后續(xù)將開(kāi)展對(duì)OsMPK15與水稻非生物脅迫應(yīng)答、激素應(yīng)答、光信號(hào)通路關(guān)系的研究，以期對(duì)其功能開(kāi)展進(jìn)一步的分析鑒定，為揭示其在體內(nèi)的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

克隆了水稻OsMPK15的cDNA編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)該基因在不同組織中表達(dá)存在差異，能夠被ABA、SA、JA高度誘導(dǎo)，同時(shí)受干旱和鹽脅迫影響，推測(cè)該基因可能與水稻的抗逆應(yīng)答過(guò)程密切相關(guān)。

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