白微微 高海峰 張航 楊安沛 李廣闊

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

麥長管蚜Sitobion avenae（Fabricius）是新疆麥區(qū)的常發(fā)性害蟲，長期以來主要使用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行防治，隨著防治次數(shù)和用藥量的不斷上升，麥長管蚜對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［1］。昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性的原因之一是體內(nèi)解毒酶活性提高，昆蟲解毒能力增強(qiáng)［2］。羧酸酯酶是昆蟲解毒酶系之一，在昆蟲頭部、中腸、馬氏管等組織中均有存在，參與激素代謝，神經(jīng)遞質(zhì)降解及農(nóng)藥解毒等［3-4］。隨著昆蟲抗藥性研究的不斷深入［5］，現(xiàn)已闡明解毒酶參與昆蟲抗藥性分子機(jī)制主要包括基因增強(qiáng)表達(dá)與基因內(nèi)部氨基酸突變兩部分［6］。有研究證明棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hübner）羧酸酯酶的mRNA過量表達(dá)對(duì)擬除蟲菊酯的抗性起重要作用［7］；Demaeght［8］等發(fā)現(xiàn)二斑葉螨 Tetranychus urticae（Koch）抗螺螨酯品系中一個(gè)酯酶基因和兩個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量升高；致倦庫蚊Culex quinquefasciatus中有機(jī)磷類殺蟲劑抗性品系的酯酶基因拷貝數(shù)量較之敏感品系多達(dá)250倍［9］；通過RNAi技術(shù)證實(shí)羧酸酯酶基因參與飛蝗Locusta migratoria manilensis對(duì)馬拉硫磷等殺蟲劑的解毒過程［10-11］，這些結(jié)果均顯示昆蟲酯酶在解毒代謝與抗藥性中的重要作用。

吡蟲啉是蚜蟲防治中廣泛使用的殺蟲劑，具有高效、低毒，與常用殺蟲劑無交互抗性的特點(diǎn)，對(duì)麥長管蚜有良好防治效果［12］。然而由于吡蟲啉長期、頻繁的使用，其抗性問題日益引起關(guān)注。目前，吡蟲啉對(duì)麥長管蚜解毒酶基因分子機(jī)理層面的影響還尚未明確。結(jié)合昆蟲解毒酶基因與抗藥性的相關(guān)研究報(bào)道，本研究通過克隆得到羧酸酯酶基因序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)吡蟲啉脅迫下的麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)進(jìn)行了初步探索，旨在研究吡蟲啉對(duì)麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)的影響，揭示羧酸酯酶基因在麥長管蚜解毒代謝中發(fā)揮的作用，為開展麥長管蚜抗性分子機(jī)制研究奠定一定基礎(chǔ)，同時(shí)該研究對(duì)于延長現(xiàn)有殺蟲劑使用壽命，降低防治成本也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：麥長管蚜采自新疆昌吉軍戶農(nóng)場，室內(nèi)用新鮮麥苗飼養(yǎng)繁殖。飼養(yǎng)條件為：溫度（23± 1）℃，光周期14：10（L：D），相對(duì)濕度RH 60%-70%。選取大小基本一致的健康無翅成蚜個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料。

主要試劑：97.4%吡蟲啉原藥為江蘇揚(yáng)農(nóng)化工生產(chǎn)；TRNzol Reagent（Total RNA提取試劑）為Invitrogen公司產(chǎn)品，F(xiàn)astQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、PCR Master Mix、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SuperReal PreMix（SYBR Green）均為北京天根生化公司產(chǎn)品，pMD 19-T Vector Cloning Kit為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定及不同濃度吡蟲啉對(duì)麥長管蚜的處理 吡蟲啉毒力測定及后續(xù)處理均采用帶蟲浸葉法，將吡蟲啉原藥用丙酮稀釋為母液，配制成不同濃度梯度，將麥長管蚜試蟲連帶小麥葉片浸入吡蟲啉藥液中10 s后取出放于濾紙上晾干，置于放有濾紙的圓形塑料培養(yǎng)皿中，用紗布覆口后將培養(yǎng)皿放于麥長管蚜常規(guī)培養(yǎng)箱中，對(duì)照試蟲使用丙酮處理，24 h后檢查并統(tǒng)計(jì)蚜蟲死亡率（輕觸蟲體時(shí)不動(dòng)計(jì)為死亡），對(duì)照死亡率小于10%數(shù)據(jù)可用。每處理均為3次重復(fù)，每重復(fù)45-60頭蚜蟲，利用SPSS 19.0計(jì)算毒力回歸方程、LC50及95%置信區(qū)間。根據(jù)毒力測定結(jié)果，用吡蟲啉LC5、LC15、LC30、LC50和LC80將室內(nèi)飼養(yǎng)的無翅成蚜按照毒力測定方法處理，24 h后挑取存活成蚜置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 取40頭蚜蟲于1.5 mL Eppendorf管中低溫勻漿，用TRNzol Reagent 進(jìn)行總RNA提取后溶于DEPC水，電泳檢測核酸質(zhì)量并測濃度。按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒的試劑說明書合成第一鏈cDNA，合成cDNA產(chǎn)物置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 麥長管蚜羧酸酯酶基因克隆及序列分析 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，克隆麥長管蚜羧酸酯酶基因。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：0.25 μL Ex Taq（5 U/μL），10 μL Ex Taq Buffer，4 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），cDNA 模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各 0.5 μL，加入 RNase-free water 補(bǔ)足至 50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將目標(biāo)產(chǎn)物使用OMEGA的Gel Extraction試劑盒割膠純化。將純化后產(chǎn)物與pMD19-T vector連接轉(zhuǎn)化至JM 109感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR檢測后挑選陽性克隆測序。測序結(jié)果及后續(xù)分析利用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 DNAMAN 8、ExPASy、MAGA 7.0、GeneDoc等軟件進(jìn)行。

表1 實(shí)驗(yàn)引物序列

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 采用qRTPCR分析麥長管蚜羧酸酯酶基因在不同吡蟲啉處理濃度下的表達(dá)差異，對(duì)照為使用丙酮處理后相同條件下飼養(yǎng)的試蟲。內(nèi)參基因Actin［13］，所用引物見表1，qRT-PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：8 μL RealMaster Mix，9.8μLRNase-free water，20×SYBR Solution 1 μL，cDNA模板（500 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集自動(dòng)完成，溶解曲線根據(jù)熒光定量PCR儀程序進(jìn)行，每樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。不同濃度吡蟲啉處理下的羧酸酯酶基因相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCt［14］計(jì)算，采用 GraphPad軟件對(duì)數(shù)據(jù)多重比較及差異顯著性分析，數(shù)值均以平均值±SE進(jìn)行表示。

2 結(jié)果

2.1 毒力測定

通過毒力測定結(jié)果計(jì)算吡蟲啉對(duì)小麥長管蚜的致死中濃度LC50為13.038 mg/L（95%置信區(qū)間為11.951-14.917 mg/L），毒力回歸方程為y=-1.148+1.030 x，根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算吡蟲啉對(duì)麥長管蚜的 LC5、LC15、LC30和 LC80值分別為 0.329、1.284、4.035和85.636 mg/L。

圖1 麥長管蚜羧酸酯酶SaEST 3（GenBank登錄號(hào)：KY 441614）推導(dǎo)的氨基酸序列與其他昆蟲羧酸酯酶的相似性比較

2.2 羧酸酯酶基因片段的克隆及序列分析

以麥長管蚜cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到一條約390 bp大小的清晰條帶，與預(yù)測片段大小基本一致。純化后連接至pMD 19-T vector中，選取陽性克隆進(jìn)行序列測定，該序列長度為392 bp，編碼130個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為14 kD，等電點(diǎn)為4.93。將其推導(dǎo)的氨基酸序列與其它昆蟲進(jìn)行序列多重比對(duì)，結(jié)果（圖1）顯示其與豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum（GenBank登錄號(hào)：XP 003248391）、麥雙尾蚜Diuraphis noxia（GenBank登錄號(hào)：XP 015367392）、夾竹桃蚜 Aphis nerii（GenBank登錄號(hào)：AAF 89552）、桃蚜Myzus persicae（GenBank登錄號(hào)：P 35502）的酯酶氨基酸序列相似性較高，分別達(dá)94%、85%、80%和80%。通過 NCBI 網(wǎng)站Conserved Domain Database保守結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖2）表明，該基因蛋白質(zhì)序列1-129位均包含在酯酶家族的保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，屬于β酯酶亞族。綜合以上結(jié)果推測所得片段為麥長管蚜羧酸酯酶基因部分片段，將其命名為SaEST 3，GenBank登錄號(hào)KY 441614。為進(jìn)一步明確麥長管SaEST 3進(jìn)化過程，對(duì)和麥長管蚜SaEST 3氨基酸序列相似性較高的昆蟲在MEGA 7.0中以N-J算法（Bootstrap 1 000）進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖3），發(fā)現(xiàn)SaEST 3與豌豆長管蚜的酯酶親緣關(guān)系最近。

2.3 羧酸酯酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)

為研究吡蟲啉對(duì)麥長管蚜羧酸酯酶基因的影響，使用不同濃度吡蟲啉（LC5、LC15、LC30、LC50和LC80）處理無翅成蚜24 h后，采用2-ΔΔCt法對(duì)羧酸酯酶基因SaEST 3的mRNA相對(duì)表達(dá)進(jìn)行處理分析，其中對(duì)照組羧酸酯酶基因相對(duì)表達(dá)量為1。結(jié)果（圖4）表明吡蟲啉對(duì)羧酸酯酶基因SaEST 3的表達(dá)有一定影響，LC5、LC50、LC80處理下SaEST 3基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到1.5以上。從LC5到LC80，隨著吡蟲啉處理濃度增加，SaEST 3基因的轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的增加，其中吡蟲啉LC5處理對(duì)羧酸酯酶SaEST 3 mRNA表達(dá)的所產(chǎn)生的誘導(dǎo)影響較其它亞致死劑量高，與LC15和LC30的差異顯著（P＜0.05），與LC50差異不顯著（P＞0.05）。LC80處理后麥長管蚜在吡蟲啉脅迫下羧酸酯酶SaEST 3 mRNA表達(dá)水平升高，與LC15和LC30相比較差異顯著（P＜0.05），與LC5和LC50相比則未達(dá)到差異顯著性水平（P＞0.05）。

圖2 麥長管蚜羧酸酯酶核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 麥長管蚜與其它相關(guān)物種羧酸酯酶氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

羧酸酯酶廣泛存在與昆蟲體內(nèi)，其對(duì)外源性化合物的水解作用增強(qiáng)是昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一［15］。目前已通過克隆技術(shù)得到多種昆蟲的羧酸酯酶基因序列［16-17］，本研究利用同源克隆方法得到1個(gè)麥長管蚜羧酸酯酶基因片段SaEST 3。通過序列比對(duì)和生物信息學(xué)分析表明SaEST 3與豌豆長管蚜等昆蟲的酯酶有較高相似性，所編碼氨基酸與其他幾種昆蟲酯酶氨基酸序列有較高相似性，定位于酯酶家族的保守區(qū)域內(nèi)，該基因片段為進(jìn)一步獲得麥長管蚜羧酸酯酶基因全長，了解結(jié)構(gòu)功能具有重要意義。

圖4 不同濃度吡蟲啉處理下麥長管蚜羧酸酯酶基因的表達(dá)水平

研究表明羧酸酯酶介導(dǎo)昆蟲對(duì)有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類及氯蟲苯甲酰胺類等多種殺蟲劑的抗藥發(fā)展［18］。羧酸酯酶主要通過提高對(duì)殺蟲劑的解毒代謝能力、阻隔殺蟲劑能力或改變酶對(duì)底物親和力發(fā)揮致使昆蟲產(chǎn)生抗性的功能［19-20］。用亞致死劑量的氯蟲苯甲酰胺連續(xù)處理小菜蛾P(guān)lutella xyllostella（Linnaeus）5代后處理組羧酸酯酶活性顯著高于對(duì)照組，表明羧酸酯酶可能參與了小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性［21］。解毒酶基因表達(dá)量變化跟抗藥性密切相關(guān)，昆蟲解毒代謝酶具有可誘導(dǎo)性，根據(jù)這一特征可推測其參與殺蟲劑解毒過程的可能性［22］，張建琴等［23］對(duì)飛蝗經(jīng)過溴氰菊酯處理后發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因表現(xiàn)為可誘導(dǎo)表達(dá)，說明其可能參與飛蝗對(duì)溴氰菊酯的代謝解毒和抗性產(chǎn)生，謝佳燕等［24］研究證明吡蟲啉不同處理劑量和時(shí)間可影響麥二叉蚜Schizaphis graminum（Rondani）啟動(dòng)酯酶蛋白表達(dá)，使蟲體內(nèi)酯酶活性有顯著性差異，黃水金等［5］發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶基因在抗性斜紋夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）中的轉(zhuǎn)錄水平與敏感品系相比高達(dá)46.85倍，由此推測羧酸酯酶基因轉(zhuǎn)錄水平升高與斜紋夜蛾對(duì)溴氰菊酯的抗藥性密切相關(guān)。

昆蟲在藥劑脅迫后可能會(huì)刺激體內(nèi)相應(yīng)的防御解毒體系來不同程度的降低毒害［25］。本研究結(jié)果說明吡蟲啉對(duì)麥長管蚜酯酶基因的表達(dá)具有一定影響，據(jù)此推測該羧酸酯酶基因SaEST 3可能與麥長管蚜對(duì)吡蟲啉的解毒代謝有關(guān)。羧酸酯酶基因在LC5處理下表達(dá)量升高，隨著吡蟲啉劑量增加呈現(xiàn)先降低后增加的表達(dá)水平，表明該基因的相對(duì)表達(dá)水平受藥劑處理濃度的影響，然而對(duì)羧酸酯酶基因在吡蟲啉處理下的具體表達(dá)模式目前并未明確。因此，為了闡明羧酸酯酶基因在麥長管蚜對(duì)殺蟲劑代謝解毒中發(fā)揮的作用，今后的研究工作將圍繞羧酸酯酶的序列結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)模式分析展開，通過對(duì)基因結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探索、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及RNA干擾等技術(shù)研究羧酸酯酶的結(jié)構(gòu)特征和驗(yàn)證麥長管蚜羧酸酯酶基因的功能，為探討麥長管蚜的抗性產(chǎn)生及解毒代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究所克隆麥長管蚜羧酸酯酶基因片段大小為392 bp，共編碼130個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為14 kD，等電點(diǎn)為4.93。序列比對(duì)和生物信息學(xué)分析顯示該基因片段與其他幾種昆蟲酯酶基因有較高相似性，命名為SaEST 3（GenBank登錄號(hào)：KY 441614）。使用熒光定量技術(shù)進(jìn)一步分析了SaEST3在吡蟲啉不同劑量處理下mRNA相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果證明吡蟲啉對(duì)麥長管蚜羧酸酯酶基因SaEST3表達(dá)有一定影響。

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