唐勇 劉旭

（1. 樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，樂山 614000；2. 樂山豐野農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，樂山 614000；3. 樂山市農(nóng)業(yè)局，樂山 614000）

以Sanger測序法［1］為代表的第一代測序技術(shù)為分子生物學(xué)研究帶來一場徹底的變革。Sanger測序技術(shù)已經(jīng)為分子生物學(xué)研究服務(wù)近40年，其為科學(xué)研究所作出的貢獻(xiàn)有目共睹。盡管第一代測序技術(shù)有著其不可替代的優(yōu)勢，但是其低通量的缺陷終究無法完全滿足研究需要。21世紀(jì)，測序技術(shù)發(fā)展進(jìn)入快車道，第二代測序技術(shù)［2］和第三代測序技術(shù)［3］相繼問世。以 Roche/454［4］、Illumina/Solexa［5］等測序平臺為代表的第二代測序技術(shù)解決測序通量和測序價(jià)格問題，引起生命科學(xué)研究方法大變革［6］，但是，第二代測序技術(shù)也遺留下測序讀長短的缺陷［7］。因此，為解決讀長問題而發(fā)明的第三代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［3］。

目前主流的第三代測序技術(shù)主要包括牛津納米孔公司（Oxford Nanopore）的單分子納米孔測序技術(shù)（The single-molecule nanopore DNA sequencing）、Helicos公司的真正單分子測序技術(shù)（True singlemolecule sequencing，tSMS） 和 Pacific Biosciences（PacBio）公司的單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)（Single-molecule real-time，SMRT）［8］。其中，牛津納米孔技術(shù)有限公司開發(fā)的單分子納米孔測序技術(shù)以超長讀長和輕便見長［9］，然而，由于其測序錯(cuò)誤率高達(dá)35%［10-11］無法在研究中推廣；Helicos公司的tSMS測序技術(shù)費(fèi)用偏高［12］，項(xiàng)目基本處于停滯狀態(tài)。目前，最成熟的第三代測序平臺莫過于基于SMRT測序技術(shù)的PacBio系列平臺。

測序技術(shù)的發(fā)展對微生物研究的推動(dòng)作用明顯，尤其是不可培養(yǎng)的微生物和復(fù)雜環(huán)境微生物的研究［13-14］。目前，微生物研究依然以第二代測序技術(shù)為主。但是，隨著基于SMRT測序技術(shù)的PacBio系列測序平臺的進(jìn)一步成熟，其必將成為微生物研究者手中的另一柄利劍。因此，系統(tǒng)了解SMRT測序技術(shù)的特點(diǎn)及其在微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展，對微生物研究者具有指導(dǎo)意義。本文將介紹SMRT測序技術(shù)的原理和特點(diǎn)，詳細(xì)列舉SMRT測序技術(shù)在微生物16S rRNA基因全長測序、宏基因組測序和微生物全基因組測序中的應(yīng)用，以及下游分析中存在的問題，旨為使用SMRT測序技術(shù)研究微生物的研究人員提供一定參考。

1 SMRT測序技術(shù)原理

和其他兩個(gè)單分子測序技術(shù)原理一樣，SMRT測序技術(shù)也采用邊合成邊測序的策略。SMRT測序技術(shù)的核心是零模波導(dǎo)孔（Zero mode waveguide，ZMW），ZMW是直徑20-50納米的納米孔，底部固定有DNA聚合酶［15］。數(shù)百納米的激光照著DNA聚合酶所在的ZMW底部而發(fā)生衍射照亮狹小的范圍，從而剛好檢測到進(jìn)入ZMW底部的堿基所攜帶熒光基團(tuán)，而避免背景干擾（圖1-A［16］）。每個(gè)ZMW可以結(jié)合一個(gè)DNA模板，其測序過程（圖1-B［16］）是：（1）DNA聚合酶捕獲DNA單鏈模板并結(jié)合在活性位點(diǎn)上；（2）被不同染料標(biāo)記的脫氧核苷酸進(jìn)入ZMW底部檢測區(qū)與聚合酶結(jié)合；（3）基于脫氧核苷酸在ZMW底部停留時(shí)間判斷是否匹配；（4）被標(biāo)記的磷酸基團(tuán)被切割并釋放［12］。

圖1 SMRT測序技術(shù)原理［16］

2 SMRT測序技術(shù)特點(diǎn)

作為第三代測序的基本特點(diǎn)，測序長度是SMRT測序技術(shù)的優(yōu)勢之一。Ferrarini等［17］使用PacBio RS平臺，P4/C2試劑對葉綠體基因組進(jìn)行測序，結(jié)果獲得平均reads長度為3 936.66 bp，一致序列的平均堿基錯(cuò)誤率為1.3%。Shearman等［18］使用最新的PacBio SR Ⅱ平臺和C4試劑測序，成功獲得長度大于26 kb的reads。理論上，在最新的PacBio SR Ⅱ平臺下，使用P6/C4試劑測序能夠獲得的最長reads可以達(dá)到60 kb［16］。由于DNA聚合酶在激光的照射下會(huì)逐漸失活，因此其測序長度不可能永遠(yuǎn)增加［19］。

測序錯(cuò)誤偏高是所有測序技術(shù)都面臨的問題。基于納米孔測序技術(shù)的MinION測序儀和基于SMRT測序技術(shù)的PacBio平臺測序reads錯(cuò)誤率分別達(dá)到 40% 和 15%［11，20］。然而，PacBio測序平臺所產(chǎn)生的測序錯(cuò)誤為隨機(jī)分布的單堿基錯(cuò)誤、插入或缺失［20-21］，憑借這一特點(diǎn)，PacBio引入環(huán)化測序的策略成功將測序準(zhǔn)確度提高，即將雙鏈模板兩端加載發(fā)夾結(jié)構(gòu)接頭，形成環(huán)狀的測序模板（SMRTbell），然后對模板循環(huán)測序［22］。該測序方案可以保證相同堿基被多次測序，結(jié)合錯(cuò)誤隨機(jī)模型，采用多重比對可以修正錯(cuò)誤堿基，從而獲得高準(zhǔn)確度reads［23］。該方案在全長16S rRNA基因測序、轉(zhuǎn)錄組測序等對reads長度要求相對較低，但是對測序準(zhǔn)確度要求較高的研究中非常有效［24-25］。

測序速度快是SMRT測序技術(shù)的另一特點(diǎn)。相比動(dòng)輒運(yùn)行數(shù)天的第二代測序技術(shù)，SMRT測序技術(shù)每個(gè)run運(yùn)行時(shí)間最短近0.5 h［16］。雖然，每個(gè)run輸出的數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及Hiseq2500等第二代測序技術(shù)，但是在對時(shí)間要求較高的情況下，SMRT測序技術(shù)無疑極具優(yōu)勢（表1），如在臨床檢測或者疫情爆發(fā)等情況下。

表1 主要高通量測序儀器參數(shù)［16，26-28］

3 SMRT測序技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用

3.1 微生物16S rRNA基因測序

自2006年，Sogin等［29］首次成功將高通量測序技術(shù)（羅氏454）用于深海環(huán)境微生物多樣性調(diào)查，16S rRNA基因高通量測序片段選擇一直存在爭議［30］，全長DNA測序無疑可以徹底終止這一爭論。SMRT測序技術(shù)在復(fù)雜環(huán)境微生物的研究中所具備的優(yōu)勢已經(jīng)被多次證實(shí)［24，31］。隨著SMRT測序技術(shù)的技術(shù)成熟和測序成本降低，第三代測序技術(shù)在16S rRNA基因測序中的應(yīng)用越來越多。

腸道微生物與宿主的生長、免疫和健康息息相關(guān)，對腸道微生物調(diào)查有利于對相關(guān)疾病的標(biāo)記與治療。2013年，Hu等［32］采集23個(gè)采用不同分娩方式出生的新生兒的糞便（10個(gè)孩子母親患有糖尿病和13個(gè)孩子母親未患糖尿?。?，采用PacBio RS平臺測序糞便中16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，分析PASS數(shù)大于3的CCS reads，結(jié)果得到與其他實(shí)驗(yàn)相反的結(jié)果：不同分娩方式對新生兒的糞便微生物沒有影響，而母親患病狀態(tài)對新生兒腸道微生物組成有顯著的影響。泡菜中含有大量乳酸菌和其他雜菌，四川家庭自制泡菜微生物的組成并不清楚。2017年，Cao等［33］在重慶7個(gè)地區(qū)采集到38份10年以上的泡菜鹽水，通過滴定法分為高酸度、中等酸度和低酸度3組。采用SMRT測序技術(shù)（PacBio SR Ⅱ/P6-C5）對38個(gè)樣本的16S rRNA基因全長進(jìn)行測序。通過分析聚類和注釋分析得來自371個(gè)屬的593個(gè)種（包括35個(gè)門），其中，Lactobacillus acetotolerans的豐度與酸度呈正相關(guān)。此外，Serratia marcescens和Stenotrophomonas maltophilia等機(jī)會(huì)致病菌也在樣本中檢測到。酸度越低，物種多樣性越高，乳酸菌屬內(nèi)的菌種越多（豐度大于1%），機(jī)會(huì)致病菌越多。該研究為自制泡菜的進(jìn)一步研究提供了參考，且表明需要對自制四川泡菜內(nèi)的機(jī)會(huì)致病菌深入研究。

3.2 宏基因組測序

宏基因組是指環(huán)境中的所有微生物基因組的總和［34-35］。2000年，Rondon等［35］首次通過構(gòu)建宏基因組文庫研究土壤微生物多樣性，并開啟了環(huán)境微生物研究的新篇章。隨著高通量測序價(jià)格大幅下跌，獲得大批原始宏基因組測序數(shù)據(jù)已經(jīng)不再是難題，而真正的研究瓶頸在于數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)。其中，微生物參考基因組缺乏是宏基因組數(shù)據(jù)分析主要障礙。目前，已有參考基因組的微生物數(shù)量與自然界存在的微生物數(shù)量相去甚遠(yuǎn)（表2）。因此，從復(fù)雜的宏基因組數(shù)據(jù)中完整而準(zhǔn)確地構(gòu)建微生物基因組草圖成為分析流程的首要任務(wù)［36］。第二代測序技術(shù)由于測序片段短的問題導(dǎo)致組裝困難，第三代測序技術(shù)有望徹底解決這一問題。

表2 微生物參考基因組統(tǒng)計(jì)

2016年，F(xiàn)rank等［37］采用Hiseq2000和PacBio RS Ⅱ兩種平臺結(jié)合的測序方式對沼氣反應(yīng)器內(nèi)的微生物宏基因組進(jìn)行研究。其中，構(gòu)建插入片段為1.5 kb的SMRTbell文庫使用P4/C2試劑測序。分別單獨(dú)組裝兩份數(shù)據(jù)，再采用混合組裝的方式組裝。結(jié)果表明，混合組裝的方式得到的組裝序列長度高于單獨(dú)組裝。該試驗(yàn)結(jié)果表明SMRT測序技術(shù)對微生物宏基因組研究有提高作用。Frank等采用混合的方式是考慮SMRT測序技術(shù)測序成本（深度）的問題，而采用較為折中的方案。事實(shí)上，隨著PacBio系列測序平臺的普及和價(jià)格快速下降，SMRT可以完全取代第二代測序。2017年，Driscoll等［38］從美國克拉馬斯湖中采集水樣并共培養(yǎng)。然后采用PacBio測序平臺進(jìn)行宏基因組測序并得到348 623條平均長度達(dá)到7 737 bp的PacBio reads，經(jīng)過質(zhì)量過濾和組裝，他們發(fā)現(xiàn)成功組裝出3個(gè)微生物基因組草圖。Driscoll等的實(shí)驗(yàn)證明SMRT測序技術(shù)在低復(fù)雜度環(huán)境微生物宏基因組組裝中是有效的。

3.3 微生物全基因組測序

對無參考基因組的物種，采用測序并從頭組裝獲得全基因組圖譜的方式稱為全基因組測序。SMRT測序技術(shù)測序長度能夠幫助研究人員在組裝全基因組時(shí)成功跨過重復(fù)片段、低復(fù)雜區(qū)域，從而組裝出完整性更好的全基因組［39］。2013年，Chin等［40］設(shè)計(jì)并開發(fā)針對SMRT測序數(shù)據(jù)組裝微生物全基因組的算法（HGAP），他們使用該方法成功組裝了包括大腸桿菌（E. coli）在內(nèi)的16個(gè)基因組，其中，3個(gè)基因組已經(jīng)有完整的基因組，新組裝的基因組與參考基因組一致性達(dá)到99.9999%。他們的實(shí)驗(yàn)證明結(jié)合SMRT測序技術(shù)和Illumina測序技術(shù)進(jìn)行全基因組測序準(zhǔn)確有效。Paulinella chromatophora是研究植物質(zhì)體的重要模式生物，2017年，Lhee等［41］研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有光合作用的新種（P. micropora sp.nov.），通過構(gòu)建SMRTbell庫，并使用PacBio RS II測序平臺測序獲得16 Gb數(shù)據(jù)，使用HGAP算法組裝得到長度為976 991 bp的全基因組。通過全基因組水平的比較證實(shí)其為新的種。

除了完全采用PacBio reads進(jìn)行全基因組組裝，通過與第二代測序技術(shù)組合的方式也是常用的微生物全基因組組裝方案，該方法能夠有效提高組裝準(zhǔn)確性并降低測序成本。葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是廣泛存在的植物病原真菌，研究人員先后使用第一代和第二代測序技術(shù)對全基因組測序，但是，其中仍然存在較多缺失和錯(cuò)誤，2016年，Van Kan等［42］采用SMRT測序技術(shù)和第二代測序技術(shù)結(jié)合的方式對葡萄孢菌全基因組測序，de novo組裝得到由18條染色體組裝的新基因組，測序深度和完整性得到大幅提高。同時(shí)，他們采用RNAseq數(shù)據(jù)對基因組進(jìn)行驗(yàn)證和基因注釋。

4 結(jié)語

微生物物種數(shù)量龐大，而環(huán)境微生物復(fù)雜性決定了其對研究技術(shù)的高要求。盡管第二代測序技術(shù)為微生物研究帶來了革命性的改變，但是，以SMRT測序技術(shù)為代表的第三代測序技術(shù)取代第二代測序技術(shù)成為微生物研究的主要手段是必然趨勢。SMRT測序技術(shù)已然領(lǐng)跑第三代測序技術(shù)。但是，SMRT測序技術(shù)仍然存在較大的問題，如測序費(fèi)用高、測序錯(cuò)誤率偏高等。

目前，SMRT測序技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域應(yīng)用最成熟且最多的還是微生物全基因組測序。而SMRT測序技術(shù)在復(fù)雜環(huán)境微生物宏基因組研究中還存在諸多問題需要解決，已有的研究也只是淺嘗輒止。目前，在我們文獻(xiàn)查閱的范圍之內(nèi)，還沒有發(fā)現(xiàn)真正將SMRT測序技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境微生物研究，因此，這方面還需要進(jìn)一步探索。SMRTbell庫構(gòu)建方法的提出為SMRT技術(shù)在微生物16S rRNA基因全長測序提供了可能，最近兩年逐漸在研究中被采用。但是，目前16S rRNA基因注釋數(shù)據(jù)庫還存在注釋物種少，參考序列長度短的問題，這無疑將降低16S rRNA基因全長測序數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。

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