羅聲臻，盛福庭，徐建立，莫春鳳

0 引言

術(shù)后認知功能障礙(POCD)是麻醉和手術(shù)后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其臨床癥狀主要包括認知能力降低、理解水平下降、記憶減退等[1]。有研究證實，POCD重要機制與Aβ刺激膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥因子和細胞因子有關(guān)[2]，但具體機制不詳。細胞焦亡是由多種病原體或非感染因素刺激導(dǎo)致的一種固有免疫反應(yīng)，是宿主細胞發(fā)生的一種依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)的程序性死亡[3]。有研究表明，Aβ聚集可以激活炎性小體并充當(dāng)caspase-1激活的平臺，對后續(xù)細胞炎癥因子的分泌和細胞焦亡起促進作用[4-5]。然而，細胞焦亡及炎性小體在POCD中的作用鮮有研究。因此，本研究旨在探討細胞焦亡及炎性小體在大鼠術(shù)后認知功能障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組 選取24只清潔級雄性SD大鼠，體重260～290 g，4月齡，購自廣東省動物實驗基地。動物房內(nèi)飼養(yǎng)7 d，室溫設(shè)置為25 ℃，濕度設(shè)定為40%，不控制飲水量，常規(guī)飲食。隨機分成4組，每組6只，分別為NS組、POCD 2W組、POCD 4W組和POCD 6W組。

采用海馬區(qū)注射Aβ1-40法制備大鼠POCD模型[6]，腹腔內(nèi)注射濃度為10%的水合氯醛350 mg/kg進行麻醉，將大鼠良好地固定于大鼠腦立體定向儀上(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，定位雙側(cè)海馬CA1區(qū)，然后鉆開顱骨，露出硬腦膜，微量進樣器(上海激光醫(yī)學(xué)儀器廠)從腦表面定位點處垂直進針，依次將Aβ1-40(使用前，用無菌生理鹽水對Aβ1-40進行稀釋處理，獲得5 μg/μL Aβ1-40，37 ℃溫度下孵育7 d，促其呈寡聚態(tài))2 μL注入POCD 2W組、POCD 4W組和POCD 6W組大鼠的雙側(cè)海馬，注射時長為5 min，留針5 min，確保Aβ1-40完全浸潤局部組織。NS組大鼠于相同位點注射等量的生理鹽水進行對照。局部消毒處理后縫合皮膚，待縫合完畢，腹腔注射慶大霉素2萬U，避免感染，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 水迷宮行為學(xué)測定大鼠認知功能 各組大鼠于術(shù)前5 d開始行Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)行為學(xué)實驗訓(xùn)練，每天訓(xùn)練4次，共持續(xù)5 d。通過池壁上的4個等距離點將水池平分成4個象限，在Ⅳ象限中心位置安放平臺，其直徑為15 cm，高度為33 cm，沒入水下1 cm。將大鼠從上述4個象限面向池壁放入水池，一直持續(xù)到其成功探尋到隱沒于水下的平臺，運用any-Maze動物行為學(xué)自動攝像分析系統(tǒng)，對大鼠的游泳速度、逃避潛伏期、上臺前路程以及搜索策略進行詳細而全面的記錄，如果90 s內(nèi)未成功發(fā)現(xiàn)平臺，通過合理的方式引導(dǎo)其登上平臺，暫時休息30 s，并將其逃避潛伏期記作為90 s。分別于術(shù)后2周和4周對POCD 2W組和POCD 4W組大鼠行Morris水迷宮行為學(xué)測試，于術(shù)后6周對NS組和POCD 6W組大鼠行Morris水迷宮行為學(xué)測試。分別于術(shù)后2、4、6周行水迷宮行為學(xué)測試后處死各組大鼠。

1.3 吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)熒光比色測定海馬內(nèi)細胞焦亡情況 水迷宮行為學(xué)測試完成后斷頭處死大鼠，迅速分離腦組織于pH 7.4的人工腦積液中分離海馬組織，使用0.25%胰酶200 μL進行剪碎消化混勻，4 ℃ 1 000 r/min離心10.5 min，取其沉淀加入50 μL AO/EB染色劑(編號KFS250，北京百奧萊博科技有限公司)后混勻并反應(yīng)1 min，用人工腦積液稀釋至200 μL，使用熒光讀板機(型號Gemini EM，Molecular Devices公司，美國)測定樣本管和空白對照管的OD值。

1.4 Western bolt法測定海馬內(nèi)caspase-1和ASC蛋白表達 應(yīng)用RIPA裂解液(Thermo公司，美國)提取海馬組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻后96 ℃水浴變性10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，置于TBS-T配5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入兔抗caspase-1抗體(Abcam公司，英國)、兔抗ASC抗體(Abcam公司，英國)及兔抗β-actin抗體(Abcam公司，英國)，4 ℃孵育過夜；TBS溶液洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG山羊抗兔二抗(Abcam公司，英國)，室溫孵育1 h；TBS-T洗膜5 min，化學(xué)發(fā)光劑ECL顯影、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。通過Scion Image軟件檢測caspase-1和ASC目的條帶，并將其和內(nèi)參照β-actin條帶的灰度值進行對比，其比值作為caspase-1和ASC的相對表達量。

1.5 ELISA法測定IL-1β和IL-10的含量 采用勻漿器進行組織研磨，冰浴下進行超聲波粉碎并制成勻漿，4 ℃離心處理后取上清液。嚴格參照ELISA測定試劑盒提供的說明書完成對海馬內(nèi)IL-1β、IL-18含量的測定。經(jīng)MK3酶標(biāo)儀讀取吸光度OD值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IL-1β和IL-18的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠水迷宮行為學(xué)結(jié)果比較 與NS組相比，POCD 2W組大鼠上臺前路程和逃避潛伏期變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而POCD 4W組和POCD 6W組大鼠上臺前路程和逃避潛伏期均延長(P<0.05)；三組大鼠游泳速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠海馬內(nèi)炎性小體相關(guān)標(biāo)記物變化比較 與NS組相比，POCD 2W組大鼠海馬內(nèi)ASC、IL-1β和IL-18變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NS組和POCD 2W相比，POCD 4W組和POCD 6W組大鼠海馬內(nèi)ASC、IL-1β和IL-18表達顯著增強(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠水迷宮行為學(xué)結(jié)果比較(n=6)

注：與NS組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠海馬內(nèi)炎性小體相關(guān)標(biāo)記物變化比較(n=6)

注：與NS組比較，*P<0.05;與POCD 2W組比較，#P<0.05

2.3 各組大鼠海馬內(nèi)細胞焦亡相關(guān)標(biāo)記物變化比較 與NS組相比，POCD 2W組和POCD 4W組大鼠海馬內(nèi)caspase-1表達和AO/EB染色OD值變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與NS組、POCD 2W組和POCD 4W組相比，POCD 6W組大鼠海馬內(nèi)caspase-1表達增強，OD值升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬內(nèi)細胞焦亡相關(guān)標(biāo)記物變化比較(n=6)

注：與NS組比較，*P<0.05;與POCD 2W組比較，#P<0.05;與POCD 4W組比較，△P<0.05

3 討論

Aβ沉積是各種原因誘發(fā)POCD的共同途徑，亦是POCD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素，過量的Aβ沉積所誘發(fā)的神經(jīng)毒性和認知障礙與其腦內(nèi)沉積的Aβ含量呈正相關(guān)。大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ1-40可使海馬神經(jīng)元線粒體腫脹、畸形，嵴斷裂、溶解，突觸小泡體積變小、結(jié)構(gòu)缺失、數(shù)量明顯減少，并導(dǎo)致嚴重的記憶減退和認知障礙[6]。因此，本研究采用既往研究的方法制備大鼠POCD模型，大鼠認知行為學(xué)的改變提示海馬區(qū)注射Aβ1-40后可導(dǎo)致大鼠發(fā)生POCD。

細胞焦亡作為一種新型的炎性相關(guān)的細胞死亡方式參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的免疫應(yīng)答[7]。神經(jīng)元在不同的刺激條件下激活caspase-1，參與促炎因子IL-1β和IL-18的釋放，發(fā)生細胞焦亡[8]。有研究表明，細胞焦亡參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變疾病的進展，如阿爾茨海默病、帕金森病、運動神經(jīng)元病等[9]。POCD的病理特征為突觸的缺失、神經(jīng)元死亡，以及細胞外神經(jīng)炎性斑內(nèi)Aβ的沉積，而細胞外增加的Aβ水平可通過多種可能的機制包括氧化應(yīng)激、興奮性中毒、能量消耗、炎癥和細胞凋亡等引起神經(jīng)元死亡[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可以激活由NLRP1介導(dǎo)的細胞焦亡，引起神經(jīng)元缺失及局部炎癥反應(yīng)[11]。Aβ能直接激活膠質(zhì)細胞分泌和釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、集落刺激因子、環(huán)氧化酶2、前列腺素等炎性趨化因子[12]，另外，七氟醚還可以通過誘導(dǎo)Aβ的聚集與沉積造成老年大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的損傷[13]。Aβ可干擾神經(jīng)膜功能并可引起K+從神經(jīng)元流出，而低K+濃度是NLRP1炎性體的有效活化劑，活化的NLRP1炎性小體參與細胞焦亡導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，從而加重神經(jīng)退行性病變，引起進行性認知障礙[14]。本研究觀察到Aβ注射6周后大鼠行為學(xué)方面出現(xiàn)明確的認知功能障礙，此時海馬內(nèi)焦亡調(diào)節(jié)通路上caspase-1表達增加效應(yīng)促炎因子IL-1和IL-18成熟，提示細胞焦亡的發(fā)生與POCD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

炎癥小體是存在于細胞質(zhì)中的一種具有廣泛活性的輪狀結(jié)構(gòu)體,能激活caspase-1，后者進一步促進促炎細胞因子IL-1β、IL-18切割和成熟，并且可以促使細胞發(fā)生焦亡[15]。細胞焦亡是一種高度依賴于caspase-1激活的炎癥性死亡方式，促進細胞焦亡的兩個必要條件是炎癥小體的活化和促炎因子IL-1β和IL-18的剪切成熟[16]，本研究結(jié)果表明，POCD組ASC和caspase-1表達顯著升高，提示炎癥小體形成后，IL-1β和IL-18的表達合成也增加，伴隨促炎因子成熟，導(dǎo)致細胞焦亡，阻斷細胞焦亡通路中任何一種物質(zhì)的活化均可影響神經(jīng)退行性腦損害的進展，從而發(fā)現(xiàn)一種POCD潛在治療靶點。本研究結(jié)果表明，POCD大鼠4周時海馬內(nèi)炎性小體即已形成，但此時細胞焦亡并不明顯，在4～6周期間，炎性小體介導(dǎo)下的細胞焦亡現(xiàn)象逐漸趨于明顯，提示POCD后4～6周可能為炎性小體促進細胞焦亡的關(guān)鍵期，因此，推測早期干擾炎性小體的形成可有效調(diào)控遠期細胞焦亡。

綜上所述，大鼠術(shù)后認知功能障礙形成的部分機制可能與海馬內(nèi)炎性小體激活后所致的細胞焦亡有關(guān)。

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