饒 紅，武福云，何華瓊*

0 引言

前列腺癌(Prostatic cancer,CaP)是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，好發(fā)于中老年男性，發(fā)病率及死亡率僅次于肺癌，嚴(yán)重危害男性生命健康[2]。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是從小檗科植物心葉淫羊藿和淫羊藿枝葉中提取的黃酮類生物堿，具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力及生殖能力等多種生物學(xué)活性，還可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遷移[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，其在Transwell小室遷移實驗中可通過干擾細(xì)胞周期而發(fā)揮抑制前列腺癌細(xì)胞株的生長、遷移和侵襲[5]。因其對活體前列腺癌原位移植瘤是否有相同的作用還鮮有研究，故本實驗首先通過原位接種建立嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)LNCaP前列腺癌原位移植瘤模型并在成模后用ICA進(jìn)行干預(yù)性治療，以觀察ICA是否會影響到活體動物前列腺腫瘤組織中脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和LNCaP細(xì)胞生物學(xué)行為，為臨床可能用于治療CaP提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SCID小鼠40只，雄性，6周齡，體重(20.0±0.5)g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，實驗室恒濕、恒溫，小鼠無菌隔離飼養(yǎng)器內(nèi)單獨飼養(yǎng)，許可證號：[SYXK(鄂)2017-0031] 。

1.2 儀器和試劑 淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索萊寶科技有限公司；乙醚購自廣州錢盛化工有限公司；人LNCaP前列腺癌細(xì)胞株、FAS ELISA試劑盒、FAS mRNA RT-PCR試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購于賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 瘤源復(fù)蘇和培養(yǎng) 先將凍存于液氮罐的人LNCaP前列腺癌細(xì)胞株冷凍管取出，37 ℃速融，倒入10 mL含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)復(fù)蘇24 h，然后更換以上培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，用0.25%的EDTA消化，注入離心管1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集底部LNCaP前列腺癌細(xì)胞株，再用RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)密度調(diào)制成2×107個/mL的細(xì)胞懸液備用。

1.3.2 SCID小鼠前列腺癌原位移植瘤模型建模方法 將SCID小鼠移入到超凈臺，用乙醚吸入麻醉后仰臥位固定，在下腹相當(dāng)于髂前上棘處延腹白線正中切口，分離腹膜，顯露腹腔內(nèi)膀胱，用醫(yī)用無菌棉簽將膀胱背側(cè)壁和頂壁向尾端翻轉(zhuǎn)，然后將生殖腺向兩側(cè)推開，找到膀胱頸處的葉狀前列腺(分左右2葉，顏色較周圍組織深)。用微量注射器抽取調(diào)制好的人LNCaP前列腺癌細(xì)胞株50 μL，左、右前列腺背外側(cè)葉包膜內(nèi)各注射25 μL，注射后以葉包膜向上鼓起并輕微脫離前列腺腺體表面為滿意標(biāo)準(zhǔn)[6]。然后分層恢復(fù)臟器解剖位置后縫合，動物清醒后放回隔離器內(nèi)。按上述步驟制作原位模型小鼠30只。動物術(shù)后單籠飼養(yǎng)，每天消毒1次，共3 d。要求動物房自然光照、恒溫恒濕(20～22 ℃，60%～70%)，小鼠自由飲純凈水，高壓滅菌飼料喂養(yǎng)。

1.3.3 實驗分組和治療 2周后，將上述30只建模SCID小鼠采用隨機數(shù)字表編號，隨機均分為前列腺癌組(CaP組)、淫羊藿苷高劑量組(80 mg/kg，高劑量組)和淫羊藿苷低劑量組(40 mg/kg，低劑量組)，每組10只，另取健康5周齡雄性SCID小鼠10只設(shè)為空白對照組(CON組)。高劑量組和低劑量組分別按80 mg/kg和40 mg/kg劑量共灌胃給藥干預(yù)性治療35 d。CaP組和CON組灌等量注射生理鹽水35 d。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 LNCaP細(xì)胞腫瘤細(xì)胞生長和細(xì)胞周期檢測 治療35 d后脫臼處死小鼠，摘取雙側(cè)前列腺瘤體，分離背外側(cè)葉包膜，用吸濕綿吸干后稱重，并測量前列腺瘤體長、短徑，每個瘤體均測量3次，以其均值為準(zhǔn)。瘤體積計算方法：瘤體積=A×B×B/2，其中A=腫瘤長徑，B=腫瘤短徑。抑瘤率=[CaP組平均瘤重-高劑量組(或低劑量組平均瘤重)] /CaP組平均瘤重×100%。瘤體積測量完成后分別編號，取部分前列腺瘤體制成組織勻漿液，流式細(xì)胞學(xué)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測LNCaP細(xì)胞周期，計算各周期比值。

1.4.2 FAS蛋白表達(dá) 取編號后保存的前列腺病理組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，以厚度為4 μm連續(xù)切片，采用SP法檢測FAS陽性蛋白表達(dá)率。判定標(biāo)準(zhǔn)以染色后細(xì)胞質(zhì)中見清晰黃至棕黃色為FAS陽性表達(dá)。

1.4.3 半定量RT-PCR檢測FAS mRNA 半定量RT-PCR檢測前列腺病理組織中FAS基因表達(dá)。用Pfimer5軟件設(shè)計PCR擴增引物序列(見表1)。采用RNA抽提試劑盒一步法提取總RNA，GAPDH為內(nèi)參，PCR擴增并對目的基因的mRNA含量進(jìn)行半定量分析。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min預(yù)變性，95、52、72 ℃各30 s，擴增35個循環(huán)。以目的基因灰度值/GAPDH灰度值之比值表示FAS基因的相對值(OD值)。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對FAS蛋白及基因表達(dá)的影響 CON組鼠前列腺病理組織中有少量FAS陽性蛋白及FAS mRNA表達(dá)。而CaP組FAS及FAS mRNA在前列腺廣泛表達(dá)，與CON組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.014、79.296，P<0.05)。治療后，高劑量組和低劑量組均明顯降低，與CaP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=79.817、93.011，P<0.05)；但兩組組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.170、0.239，P>0.05)。見表2。

表2 淫羊藿苷對FAS蛋白及基因表達(dá)的影響(n=10)

注：與CON組比較，*P<0.05；與CaP組比較，#P<0.05

2.2 淫羊藿苷對腫瘤細(xì)胞生長的影響 治療后，與CaP組比較，高劑量組和低劑量組瘤重量、瘤體積均低于CaP組，抑瘤率高于CaP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=76.394、103.471，P<0.05)；但兩組組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.094、0.193，P>0.05)。見表3。

表3 淫羊藿苷對腫瘤細(xì)胞生長的影響(n=10)

注：與CaP組比較，#P<0.05

2.3 淫羊藿苷對細(xì)胞周期的影響 FCM檢測顯示，CaP組G0/G1明顯高于CON組,而S期明顯低于CON組(F=91.257、112.653，P<0.05)。治療后，高劑量組和低劑量組前列腺癌LNCaP細(xì)胞阻滯于S期，其G0/G1比值明顯降低，S期明顯提高，與CaP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.269、97.304，P<0.05)；但兩組組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.412、0.107，P>0.05)。見表4。

表4 淫羊藿苷對細(xì)胞周期的影響(n=10)

注：與CON組比較，*P<0.05；與CaP組比較，#P<0.05

3 討論

FAS是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，研究顯示，F(xiàn)AS在多種惡性腫瘤中表達(dá)增強，患者多出現(xiàn)脂肪酸代謝紊亂現(xiàn)象。目前，F(xiàn)AS已被證實在CaP腫瘤組織中高表達(dá)，因其驗出率及特異度高，目前已成為CaP的惡性程度、是否轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的重要參考指標(biāo)[7]。目前,對CaP的治療以去勢、抗癌藥、化療為主，中醫(yī)中藥治療為輔，有研究表明，中藥可通過調(diào)節(jié)雄激素受體信號通路而達(dá)到治療目的[8-9]。淫羊藿是補益類中草藥，具有強筋祛濕補腎的作用，主治虛冷不育、陽痿遺精、腎虛喘咳、尿頻失禁、風(fēng)濕痹痛、半身不遂、腰膝酸軟等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿提取物ICA具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)提高免疫力、抑制破骨細(xì)胞活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長等作用[10-11]。另外，淫羊藿苷還用于治療性功能障礙，在治療腫瘤時還具有抗細(xì)胞凋亡、增強腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性的作用[12-13]。

在本研究中，筆者預(yù)實驗顯示，LNCaP前列腺癌原位移植瘤模型SCID小鼠前列腺均有移植瘤生長，且腫瘤廣泛浸潤小鼠精囊、膀胱等周圍盆腔組織和臟器，形成固定的實質(zhì)性團(tuán)塊，說明造模成功。在正式實驗中，結(jié)果表明，ICA可降低FAS蛋白及其基因表達(dá)。FASE具有多種催化功能，是合成脂肪酸的功能酶，在惡性腫瘤組織中FASE異常高表達(dá)，高表達(dá)的FAS會催化內(nèi)源性脂肪酸的大量合成，而內(nèi)源性脂肪酸是腫瘤細(xì)胞生長必需的脂肪酸，因此，F(xiàn)ASE高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)其惡性生長的需求[14]。筆者認(rèn)為，ICA可通過抑制FAS合成，降低內(nèi)源性脂肪酸的合成，間接降低腫瘤細(xì)胞生長所必需的脂肪酸供給，使生長速度減緩?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生涉及多個基因和蛋白，如Rb、p21、p53、p16、BRCA1、p15等調(diào)控基因在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)生基因改變、失活，并由此造成細(xì)胞周期監(jiān)測功能缺陷[14-15]。另外，惡性腫瘤生長的最基本生物學(xué)特征就是腫瘤細(xì)胞失控性增殖，即細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，目前使用的抗癌藥主要作用于G2/M期和S期，可使失控性增殖的腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期和S期[16]。研究表明，藥用植物及其提取物甾醇、單體等能夠誘導(dǎo)非正常細(xì)胞周期細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象，促使腫瘤細(xì)胞脫噬而發(fā)揮抗癌作用[17]。從本實驗結(jié)果來看，高劑量組和低劑量組S期細(xì)胞比值升高、G0/G1期細(xì)胞比例降低，與CaP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明ICA可將接種的LNCaP 前列腺癌細(xì)胞阻滯在S期。另外，高劑量組和低劑量組瘤體積和瘤重量明顯低于CaP組，F(xiàn)CM檢測顯示抑瘤率分別為39.47%和37.28%，表明ICA對前列腺癌細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。

總之，本研究表明，ICA可明顯抑制前列腺癌原位移植瘤的生長，推測淫羊藿苷可能通過抑制FAS來降低腫瘤細(xì)胞生長必需的內(nèi)源性脂肪酸的合成，并使失控性增殖的腫瘤細(xì)胞阻滯在S期，調(diào)節(jié)LNCaP細(xì)胞生物學(xué)行為，明顯抑制其生長、遷移與侵襲能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長抑制，為ICA開發(fā)后可能應(yīng)用于臨床治療CaP提供了理論參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王貽兵,劉丹,王佳賀.JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡中的作用[J] .實用藥物與臨床,2016,19(9):1065-1068.

[2] 李漢忠,張玉石.2016年前列腺癌診治熱點回顧[J] .中華外科雜志,2017,55(1):59-62.

[3] 李釗,王雄彪.淫羊藿苷的研究進(jìn)展[J] .現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,24(8):908-910.

[4] 張黎聲,韓小晶,羅志榮,等.淫羊藿苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移作用的影響[J] .中國中醫(yī)藥信息雜志,2017,24(2):44-48.

[5] 張溫花,張文超,于遠(yuǎn)東.淫羊藿苷對前列腺癌細(xì)胞株活力、遷移與侵襲的作用[J] .中國病理生理雜志,2017,33(6):1017-1020.

[6] 王金秋,李志,何丹,等.SCID小鼠原位接種LNCaP前列腺癌模型的建立[J] .北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院學(xué)報,2012,26(5):19-22.

[7] 王科峰,陳小楠,詹運洪,等.脂肪酸合成酶與ECT骨顯像對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷價值[J] .現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(4):802-804.

[8] 曹愛嬌,邵瑞,王彧.中藥通過調(diào)節(jié)雄激素受體信號通路治療前列腺癌的研究進(jìn)展[J] .中國臨床藥理學(xué)雜志,2017,33(13):1263-1266.

[9] 朱華宇,李玉潔,吳元勝.脫水淫羊藿素與金雀異黃酮對MCF-7、MDA-MB231細(xì)胞株增殖的影響研究[J] .現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2017,26(7):685-697.

[10] 張淑琴,贠向陽,鄭倩,等.淫羊藿素對3種人腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的比較[J] .中華實驗外科雜志,2015,32(8):1919-1921.

[11] 紀(jì)昕,王崇,李潔,等.淫羊藿苷通過增強 Fas-FasL 表達(dá)活性誘導(dǎo)裸鼠食管癌細(xì)胞凋亡[J] .重慶醫(yī)學(xué),2016,45(12):1608-1611.

[12] Xu SF,Jin T,Lu YF,et al.Effect of icariin on UDP-glucuronosyl-transferase in mouse liver[J] .Pianta Medica,2014,80(5):387-392.

[13] 黃榕芳,何誠,朱偉峰,等.p16、GATA3表達(dá)及人乳頭狀瘤病毒分型檢測在宮頸癌累犯膀胱病理診斷中的價值[J] .中華病理學(xué)雜志,2017,46(6):388-392.

[14] 李欣.脂肪酸合酶在腫瘤中的研究進(jìn)展[J] .腫瘤研究與臨床,2015,27(10):717-720.

[15] 張嘉穗,陳惠,魏國清,等.脂肪酸合酶——抑制腫瘤的新靶點[J] .華西藥學(xué)雜志,2014,29(5):599-601.

[16] 詹啟敏,陳杰.細(xì)胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)[J] .中國腫瘤臨床,2014,41(1):1-7.

[17] 曹玫,歐陽露.植物甾醇的抗腫瘤作用及其機制研究進(jìn)展[J] .實用藥物與臨床,2015,18(9):1104-1107.