邢 丹，趙穎梅*，劉志輝，張芳菲,李克冉

0 引言

嬰幼兒腫瘤中，腦部腫瘤的發(fā)病率僅次于白血病。近年來，使小兒腦腫瘤的治愈率有所提高，但除了髓母細胞瘤，其他腦腫瘤的治療結局并沒有太大改善[1]。阻礙小兒腦瘤治療進步的主要原因是缺乏對于腦瘤發(fā)病分子機制的了解以及有效的臨床靶向藥物的使用。

髓母細胞瘤(Medulloblastoma)是兒童腦瘤中發(fā)病率最高的原發(fā)于小腦的惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，可以發(fā)生在嬰兒、青少年和成人時期，根據(jù)基因表達類型分為4個亞組：wingless (WNT)組、sonic hedgehog (SHH)組、組3和組4。其中WNT組和SHH組分別是以患者WNT和SHH信號通路的不正?；罨癁樘卣鱗2]，而組3和組4命名是由于缺少明確的信號通路。目前，除了WNT類髓母細胞瘤和小于4周歲的兒童SHH髓母細胞瘤患兒有較好的預后，其他大部分患兒通常預后極差[3-4]。目前，我們仍然缺乏提高無瘤生存期和總體生存期的針對惡性髓母細胞瘤的有效的化療藥物。

甲硫噠嗪(Thioridazine，THIO)作為吩噻嗪(Phenothiazine)的派生物，是一種被廣泛應用于精神分裂癥等精神類疾病的有效的安定劑。近年研究表明，THIO對胃癌、子宮頸癌、乳腺癌、成神經(jīng)細胞癌、卵巢癌等多種腫瘤具有抑制增殖和促進凋亡的作用[5-6]。進一步的研究表明，甲硫噠嗪在卵巢癌中具有抑制PI3K/AKT信號通路，下調Cyclin D1并上調細胞增殖抑制因子p21的作用[7]。而且THIO還具有對白血病腫瘤干細胞特性細胞的專一抑制性，而對正常血細胞沒有抑制作用[8]。本研究利用人髓母細胞瘤細胞株DAOY，考查THIO對人髓母細胞瘤的抑制及其機制；在細胞水平檢測最佳給藥劑量并檢測THIO對于腫瘤細胞轉移和腫瘤干細胞特性的影響，為臨床應用THIO治療髓母細胞瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和甲硫噠嗪 人類正常肝細胞系L02、小鼠3T3細胞株和人髓母細胞瘤細胞株DAOY均購自中科院上海生命科學院細胞庫。所有細胞常規(guī)采用高糖DMEM加10%胎牛血清(購自Gibico公司)。甲硫噠嗪(THIO，>99%，批號：Y0000704)和DMSO(批號：D2650)購自Sigma-Aldrich公司。THIO先用DMSO溶解配成100 mmol/L的存儲液，使用時再用DMSO配成相對應1 000×的工作液。

1.2 細胞活力檢測 采用CCK8(南京凱基公司，批號：KGA317)檢測細胞活力以反映生存的細胞數(shù)量。將正生長在透明96孔板的細胞更換為含有10% CCK8的完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育1～4 h，使用酶標儀檢測450 nm吸光度數(shù)值，減去空白對照數(shù)值，得到與細胞數(shù)呈正比的數(shù)值。

1.3 細胞周期和凋亡檢測 將DAOY細胞先按照3×105/孔的密度接種到6孔板中，加入一定濃度的THIO孵育相對應時間后，收集細胞，使用PBS洗滌細胞2次后，重懸并加入5 mmol/L的NP-40和1 mg/mL的RNA酶A 37 ℃孵育1 h。使用propidium iodide (PI，>94%，批號：P4170，購自Sigma-Aldrich)染色細胞15 min后，流式FACS MoFlo XDP (Beckman Coulter)分析細胞周期。使用Annexin-V/PI(Annexin-V購自Sigma-Aldrich，批號：A9210)雙染色細胞15 min，流式FACS MoFlo XDP (Beckman Coulter)分析細胞凋亡，Annexin-V和PI染色雙陽性細胞為發(fā)生凋亡細胞。

1.4 細胞遷移實驗和細胞自我更新實驗 將在THIO處理24 h DAOY細胞和對照DAOY細胞采用無血清DMEM重懸后，以1×105/孔的密度加到Transwell(Corning Incorporated Costar，批號：3422)的濾網(wǎng)杯內，在杯外加入500 μL含10%胚牛血清的DMEM。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小杯子，4%多聚甲醛中固定20 min后0.1%結晶紫中染色15 min，用棉棒擦去小杯子內部的細胞后，顯微鏡下拍照穿過膜的細胞。

細胞自我更新實驗采用含有B27(購自Invitrogen，批號：17504-044)的DMEM/F12培養(yǎng)基(購自Invitrogen，批號：11320-033)，并在其中加入胰島素 (4 μg/mL，購自Sigma-Aldrich，批號：I0516)、EGF (20 ng/mL，購自Sigma，批號：E4269)和bFGF (10 ng/mL，購自Life Technologie，批號：13256-029)。將細胞使用以上培養(yǎng)基重懸后，種入低黏附6孔板內，對照組加入2 μL DMSO，實驗組加入相應濃度的THIO，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d后，對細胞進行計數(shù)和拍照。

1.5 RNA提取和定量PCR 采用TRIzol solution(Life Technologies，批號：15596-026)裂解細胞并提取細胞內RNA，使用逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit,大連寶生物，批號：6210A)反轉錄成cDNA。對相應基因表達設計引物，見表1，利用SYBR?Fast qPCR Mix (大連寶生物，批號：RR430S)進行定量PCR。

2 結果

2.1 不同濃度THIO對髓母細胞瘤細胞株DAOY的增殖抑制作用 利用CCK8考察不同濃度梯度的THIO對人髓母細胞瘤細胞株DAOY的抑制作用。將正常人永生化肝細胞L02和小鼠3T3細胞株作為正常細胞對照。THIO對于髓母細胞瘤細胞株DAOY的抑制是濃度依賴的，10 μmol/L和50 μmol/L都對DAOY有較強的增殖抑制作用，而1 μmol/L的濃度基本沒有抑制作用，見圖1。同時，為了考察THIO作為臨床治療腫瘤藥物的可能性，我們檢測了不同濃度THIO 對于人類正常細胞株的毒副作用。可以看到10 μmol/L的THIO對于L02和小鼠細胞株3T3的增殖影響較小，而50 μmol/L都具有較強的抑制作用，見圖2、圖3。為進一步考察THIO對DAOY細胞增殖的抑制作用，我們使用10 μmol/L THIO處理DAOY細胞株0～3 d后，使用流式細胞術檢測細胞周期和凋亡。與沒有THIO處理的對照細胞相比，THIO處理抑制細胞周期進展，減少細胞在G2/ M和S期分布并且與處理時長呈正相關，見表2。同時，與對照組相比，THIO促進DAOY凋亡并且也與處理時長呈相關，見表2。

表1 定量PCR引物序列

圖1 不同濃度THIO對于DAOY細胞生長的影響

圖2 不同濃度THIO對于L02細胞生長的影響

圖3 不同濃度THIO對于3T3細胞生長的影響

表2 THIO處理對DAOY細胞周期和細胞凋亡的影響(n=3)

2.2 THIO對DAOY細胞轉移能力和在低糖條件下生存能力的影響 THIO處理3 d后檢測細胞穿膜能力，結果表明，THIO明顯抑制了DAOY細胞的轉移能力，見圖4。腫瘤細胞的另一個特點是快速增殖，快速增殖的腫瘤細胞往往處于低糖的饑餓環(huán)境中，本研究應用葡萄糖濃度為1 g/L的低糖DMEM(LGM)作為饑餓培養(yǎng)基模擬腫瘤的低糖環(huán)境。將10 μmol/L THIO加入到LGM用作DAOY細胞的培養(yǎng)基，與對照組加入DMSO相比，THIO明顯降低了DAOY細胞在LGM培養(yǎng)基的生存率，見圖5。為進一步研究DAOY細胞生存減少的機制，本研究檢測THIO處理后DAOY細胞的糖攝取能力和ATP水平。發(fā)現(xiàn)THIO顯著降低了DAOY細胞的糖攝取能力和ATP水平，見圖6、圖7。

圖5 THIO處理降低DAOY在低糖條件下(LGM)的生存能力

圖6 THIO處理降低DAOY對葡萄糖的攝取能力

圖7 THIO處理降低DAOY在低糖條件下ATP水平

2.3 THIO對DAOY細胞腫瘤干細胞特性基因表達和自我更新能力的影響 具有腫瘤干細胞特征的細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。我們檢測THIO處理對于干細胞特性基因表達的影響。10 μmol/L THIO處理DAOY細胞3 d后，CD133、CD90、Oct4、Sox2和KLF4表達顯著下降，而C-myc和Nanog表達也有所下降。同時，10 μmol/L THIO處理DAOY細胞也明顯降低腫瘤細胞的自我更新能力，見圖8、表3，顯著減少腫瘤成球(Spheroid)的形成數(shù)量，并降低細胞成球的直徑，見表4。

3 討論

THIO是美國食品與藥品管理局(FDA)批準的安寧類藥物，在臨床上廣泛用于治療精神分裂癥和精神類疾病。最近的研究表明，THIO對多種腫瘤具有抗腫瘤生長和抵制腫瘤干細胞增殖的作用。THIO是多巴胺受體D2 (DRD2)抑制劑?？梢哉{節(jié)WNT和AKT信號通路，并且可以誘導胚層細胞的凋亡[9-10]。THIO能導致DNA斷裂和增加Caspase-3表達[11]。近年來，國內已有研究表明，THIO對子宮內膜癌和結腸癌具有抑癌作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，THIO在合適的濃度范圍內可以對髓母細胞瘤細胞DAOY起到有效的殺滅作用，而對正常細胞抑制作用較小。

圖8 THIO降低DAOY細胞腫瘤自我更新能力

表3 THIO處理降低DAOY細胞自我更新能力(n=5)

惡性腫瘤中占較少比例的腫瘤干細胞(CSCs)，又稱腫瘤起始細胞(TICs)，具有自我更新能力、無限增殖能力，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移有重要作用[14]。因此，靶向CSCs對腫瘤的消除，特別是發(fā)生轉移的腫瘤的治療至關重要。本研究顯示，THIO可有效降低髓母細胞瘤細胞中腫瘤干細胞特性基因的表達，因此，可能對腫瘤干細胞的增殖和自我更新有重要的抑制作用。

綜上所述，10 μmol/L THIO對髓母細胞瘤細胞系DAOY的增殖能力和低糖條件下的生存能力有明顯的抑制作用。此外，其對于腫瘤干細胞特性基因的表達也有明顯下調的作用，為THIO用于臨床治療髓母細胞瘤提供了理論基礎。

表4 THIO處理對腫瘤干細胞特性基因表達的影響(n=3)

注：與對照組(THIO 0 μmol/L)比較，*P<0.05

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