， ，， ，， (.延安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安 76000；.延安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安 76000)

乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的癌癥之一，占全球女性中所有新發(fā)癌癥的29%(246/660)[1]。越來越多的證據(jù)支持乳腺腫瘤發(fā)生與癌基因的異常表達(dá)有關(guān)[2]。例如，HER2高表達(dá)是HER2+乳腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[3]；BRAC1和BRAC2在病理性高級(jí)別乳腺癌中經(jīng)常出現(xiàn)啟動(dòng)子甲基化、體細(xì)胞突變和基因缺失的異常表達(dá)[4]。乳腺腫瘤發(fā)生病理機(jī)制多樣，值得注意的是，癌癥具有抵抗細(xì)胞死亡和逃避生長抑制因子的特征，這也是導(dǎo)致腫瘤最終惡化的關(guān)鍵原因[5]。尋找新的調(diào)節(jié)分子抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是治療乳腺癌的潛在治療策略。

microRNA代表內(nèi)源性非編碼RNA的大家族，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。有研究已經(jīng)證明，miRNA通過介導(dǎo)腫瘤發(fā)生的每一個(gè)步驟，包括增殖、凋亡、存活、遷移和侵襲，許多microRNA發(fā)揮著其作為促癌因子或腫瘤抑制基因的功能[7-8]。已有報(bào)道顯示，位于染色體區(qū)域15q24.1的miR-630的表達(dá)失調(diào)參與了幾種人類惡性腫瘤的進(jìn)展[9]。例如，miR-630的表達(dá)增加與胃癌總體生存率差有關(guān)[10]；在缺氧條件下，上調(diào)的miR-630促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展[11]。之前的研究表明，miR-630在各種乳腺癌細(xì)胞系以及臨床乳腺癌組織中下調(diào)。miR-630通過靶向MTDH抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[12]。然而，除了抑制乳腺癌的遷移和侵襲外，miR-630在乳腺癌進(jìn)展的其他步驟(如細(xì)胞增殖或凋亡)中是否發(fā)揮其腫瘤抑制功能還需要進(jìn)一步研究。

B細(xì)胞特異性病毒整合位點(diǎn)1(BMI1)是polycomb群復(fù)合物1(PRC1)的主要成分，在DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、細(xì)胞永生化和衰老過程中扮演著多重角色[13-14]。重要的是，BMI1的上調(diào)與某些癌癥患者的化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[15]。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-630通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，我們將BMI1鑒定為miR-630的新靶基因，揭示了miR-630通過直接調(diào)控乳腺癌細(xì)胞系BT-549中BMI1表達(dá)水平發(fā)揮其功能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年3月至2015年3月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院收集了40例組織標(biāo)本，其中包括乳腺癌癌組織和相鄰的正常組織。所有樣本均立即保存在液氮中。手術(shù)后，儲(chǔ)存在-80 ℃直到RNA提取。所有組織診斷都具有病理和/或細(xì)胞學(xué)證據(jù)。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自上海吉?jiǎng)P基因，Trizol購自美國Ambion公司。PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成。Transwell小室購自美國Millipore公司(Millipore，Billerica，MA)，Matrigel購自Bio-Rad (Bio-Rad，Madrid，Spain)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人類乳腺癌細(xì)胞系(BT-549)獲自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海)。所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清和100 u/mL青霉素或100 mg/mL鏈霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃含5%CO2的恒溫孵箱中。

1.3 RNA分離和定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)分析

使用TRIzol試劑從組織或細(xì)胞中分離總RNA，并按照制造商的說明書用逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR的條件如下：94 ℃10 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 15 s，然后40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)使用miR-630的特異性引物(正向引物，5’-TTGAGCTGGATTGGCGGGAT-3’和反向引物5’-TTGACGGATGCGGAGGGCT-3’)。作為對(duì)照，用特異性引物(正向引物5’-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3’和反向引物5’-TGACGCTTGCCCACAGCCTT-3’)擴(kuò)增U6。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-630模擬物和相應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-NC)分別轉(zhuǎn)染到實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株中。按照生產(chǎn)商的說明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將模擬物或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行基因表達(dá)分析和細(xì)胞增殖和侵襲測(cè)定。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告分析

BMI1的野生型(Wt)和突變型(Mut)3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-UTR)由生物技術(shù)公司提供設(shè)計(jì)制備，并克隆到pMIR-Report質(zhì)粒中，稱為BMI1-WT和BMI1-Mut。對(duì)于熒光素酶測(cè)定，將1×105個(gè)細(xì)胞鋪板并在12孔板中培養(yǎng)以達(dá)到約70%匯合。細(xì)胞與miR-630模擬物或NC共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)BMI1Wt/Mut報(bào)告質(zhì)粒的熒光表達(dá)活性。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞增殖測(cè)定

細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板(每孔5 000個(gè)細(xì)胞)中。使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)在接種細(xì)胞24、48、72 h后測(cè)量細(xì)胞增殖。使用微孔板分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞周期分析

使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson)測(cè)定細(xì)胞周期分布。轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞。將細(xì)胞消化并隨后在4 ℃下在70%乙醇中固定過夜。然后將固定的細(xì)胞在室溫下用50 μg/mL碘化丙錠(BD Biosciences)在黑暗中染色30 min。用FACS Calibur系統(tǒng)和ModFit 3.0軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 集落形成實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行集落形成試驗(yàn)以評(píng)估轉(zhuǎn)染的BT-549細(xì)胞的增殖能力，將BT-549細(xì)胞在24 h后收獲，然后接種到新的6孔板(200細(xì)胞/孔)中并培養(yǎng)約2周，直到觀察到集落形成。然后，將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定，并通過Giemsa試劑染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0版(IBM，USA)進(jìn)行分析，并用至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。使用ANOVA或雙向t檢驗(yàn)比較組間差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-630誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制增殖

為了確定miR-630是否能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，觀察分別轉(zhuǎn)染了miR-630模擬物或miR-NC的侵襲性乳腺癌細(xì)胞系BT-549細(xì)胞的形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-630異位過度表達(dá)的細(xì)胞呈泡狀，萎縮和脫離基質(zhì)，類似于細(xì)胞凋亡的特征(圖1a)。此外，miR-630轉(zhuǎn)染的BT-549細(xì)胞中的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與在24 h、48 h、72 h和96 h的miR-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比顯著增加，表明miR-630可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡(圖1b)。

a:經(jīng)過miR-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;b:miR-630轉(zhuǎn)染后凋亡的細(xì)胞;c:Tunel陽性細(xì)胞數(shù) *:與miR-NC比較,P<0.05圖1 miR-630誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制增殖

2.2 miR-630誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并減少乳腺癌細(xì)胞的集落形成

細(xì)胞周期變化總是與細(xì)胞生長停滯和凋亡相關(guān)，細(xì)胞周期分析顯示，在miR-630轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后，miR-630在G1/G0期顯著增加BT-549細(xì)胞中的細(xì)胞百分比(從49%至70%)，見圖2。除了細(xì)胞無限生長和細(xì)胞凋亡抗性外，克隆增殖是腫瘤發(fā)生過程的另一個(gè)重要步驟。因此，在miR-630異位表達(dá)的BT-549細(xì)胞中使用集落形成測(cè)定法。如圖3所示，與對(duì)照組相比，在miR-630過表達(dá)的細(xì)胞中形成顯著較少的集落。這些結(jié)果表明miR-630的異位表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制乳腺癌細(xì)胞的克隆增殖。

#：P<0.01圖2 MiR-630誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯

a:miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞集落形成；b:miR-630轉(zhuǎn)染細(xì)胞集落形成；c:轉(zhuǎn)染細(xì)胞集落形成的定量分析 *：與miR-NC比較,P<0.05圖3 miR-630減少乳腺癌細(xì)胞的集落形成

2.3 BMI1是miR-630的直接靶基因

為尋找miR-630的有效功能目標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用3種在線計(jì)算miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)算法(TargetScan，PicTar和miRanda)，并重點(diǎn)研究凋亡相關(guān)和細(xì)胞周期相關(guān)基因，結(jié)果篩選出候選目標(biāo)基因BMI1。根據(jù)Targetscan預(yù)測(cè)，BMI1的3′非翻譯區(qū)(UTR)(1812-1819)上有一個(gè)miR-630結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。為了驗(yàn)證BMI1是否是miR-630的直接靶標(biāo)，我們將BMI1 3′UTR的野生型和4bp突變體形式分別插入海腎熒光素酶基因下游的psiCHECK-2載體中(圖4)，miR-630顯著抑制BT-549中海腎熒光素酶活性，當(dāng)miR-630的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，HEK293T細(xì)胞受損,提示BMI1是miR-630的直接靶基因。

#:P<0.01;△:P<0.001圖4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMI1是miR-630的直接靶基因

2.4 BMI1參與miR-630調(diào)控的乳腺癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期阻滯和增殖抑制

在用siRNA消除BMI1使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到85%后，使用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行凋亡率檢測(cè)，在指定時(shí)間點(diǎn)，凋亡率連續(xù)增加；同時(shí)，抑制BMI1可阻斷BT-549細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞周期。BMI1沉默的BT-549細(xì)胞的增殖和克隆形成能力也被顯著抑制(圖5)。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了BMI1介導(dǎo)miR-630抑制乳腺癌進(jìn)展的功能的觀點(diǎn)。

a:siNC干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成；b:siMBI1-1干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成；c：siMBI1-2干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成；d:定量分析不同干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

圖5轉(zhuǎn)染MBI1后對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響

3 討論

miR-630在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)順鉑耐藥的產(chǎn)生，并在細(xì)胞周期的G0/G1期中增加了被阻滯的細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致A549細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性增強(qiáng)[16]。在隨后的研究中，對(duì)于miR-630在不同類型的腫瘤類型中已經(jīng)提出了腫瘤抑制和腫瘤促進(jìn)的差異作用。miR-630的表達(dá)在肝細(xì)胞癌組織中顯著增加，缺氧條件下在卵巢癌細(xì)胞中誘導(dǎo)其凋亡進(jìn)展[17]。在乳腺癌組織中，miR-630表達(dá)水平下調(diào)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移并增加藥物敏感性[18]。為了進(jìn)一步揭示miR-630腫瘤抑制功能的機(jī)制，本研究檢測(cè)了miR-630在乳腺癌細(xì)胞系中的凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞生長的功能機(jī)制。此外，我們還提出miR-630阻斷細(xì)胞周期過程并抑制乳腺癌細(xì)胞的再生。這與Zhou等[19]提出的miR-630異位過表達(dá)上調(diào)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p27和DNA損傷敏感標(biāo)記pγH2AX等蛋白的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致，進(jìn)一步支持了miR-630的細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)功能。

BMI1是polycomb組家族成員，在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[20]。有研究顯示其在正常干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖調(diào)控活性中起作用，其高表達(dá)與化療耐藥呈正相關(guān)[21]。BMI1的高度激活可以繞過細(xì)胞衰老，并因此通過促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)腫瘤發(fā)生和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)，BMI1通過結(jié)合并穩(wěn)定催化亞基RING2/RING1b來催化組蛋白H2A(H2A-K119Ub)賴氨酸(K)119處的單泛素化，從而增強(qiáng)PRC1的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而修飾染色質(zhì)并抑制多個(gè)基因位點(diǎn)，其中定位了促進(jìn)p53-pRb軸功能的腫瘤抑制基因[22]。在神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)中，shRNA介導(dǎo)的BMI1減少導(dǎo)致p21表達(dá)的顯著增加，并且隨后作為胚胎和成人NSC增殖和自我更新的關(guān)鍵介質(zhì)[23]。因此，BMI1的功能性失活頻繁阻斷細(xì)胞周期中G1期至S期的轉(zhuǎn)變并導(dǎo)致凋亡，說明BMI1是一個(gè)重要的癌基因。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)BMI1是miR-630的直接靶基因。此外，利用兩種特異性靶向siBMI1的RNA干擾技術(shù)抑制BMI1的表達(dá)，并成功模擬miR-630的功能，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起腫瘤細(xì)胞G0/G1期周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖和集落形成能力。

近來，已經(jīng)報(bào)道了幾種miRNA，包括miR-16、miR-128、miR-141、miR-183、miR-203、miR-200c、miR-200b能夠靶向BMI1并影響其功能[24]。例如，miR-15a和miR-16介導(dǎo)BMI1的表達(dá)下調(diào)，其阻礙DNA修復(fù)，而升高的水平可以使乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。miR-128特異性阻斷符合BMI1下調(diào)的膠質(zhì)瘤自我更新[26]。眾所周知，特定的miRNA可以靶向不同的基因，并且特定的蛋白質(zhì)編碼基因可以被不同的miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。因此，包括miR-630、miR-16、miR-128、miR-200c等在內(nèi)的一組miRNA可能包含一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，通過調(diào)控BMI1在乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-630可以靶向BMI1，從而誘導(dǎo)BMI1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，以及乳腺癌細(xì)胞的再生阻斷。上述數(shù)據(jù)提供了miR-630依賴性BMI1對(duì)乳腺癌細(xì)胞整體調(diào)控的機(jī)制，以及抑制其進(jìn)展的全面分析，并提供了治療乳腺癌的治療潛力，為miR-630和BMI1成為乳腺癌臨床治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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