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        不同提取工藝對猴頭菇多糖產(chǎn)率、單糖組成及DPPH清除活性的影響

        2018-06-29 05:07:08李珊珊王珊丹燕洪濤陳建波孫印石
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年11期
        關(guān)鍵詞:猴頭菇單糖果膠酶

        李珊珊,王珊丹, 燕洪濤, 陳建波, 孫印石

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林長春 130112; 2.吉林省人民醫(yī)院,吉林長春 130021; 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長春 130041)

        猴頭菇(Hericiumerinaceus)別稱猴頭菌、刺猬菌,屬擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科猴頭屬[1]。在我國多地均有分布,尤其在長白山脈資源豐富,是一種非常具有特色的食用菌類。猴頭菇含有多種營養(yǎng)成分,如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、氨基酸等[2]。多糖是猴頭菇的重要活性成分,已被證實(shí)具有保護(hù)胃黏膜[3]、增強(qiáng)免疫力[4-6]、抗腫瘤[7-9]、抗疲勞[10]等多種功效。關(guān)于猴頭菇多糖的研究已經(jīng)越來越受重視,但多以活性研究為主,提取方法和單糖組成研究較少,一定程度上限制了猴頭菇多糖的應(yīng)用。針對上述現(xiàn)狀,以猴頭菇為原料,分別比較了熱水煮提、超聲提取、果膠酶提取、淀粉酶提取5種提取方式對猴頭菇多糖的產(chǎn)率、總多糖含量和單糖組成的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        猴頭菇采購于吉林省長春市立新參茸特產(chǎn)超市;果膠酶、淀粉酶采購于河南正興食品添加劑有限公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品采購于Sigma-Aldrich公司;DPPH采購于Coolaber公司(Cat# CD4891-500MG);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 主要儀器

        TGL-16A高速臺式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1A-50低溫冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司;超聲波清洗機(jī)JP-100ST,深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋HHS型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

        高效液相色譜儀及色譜柱:紫外檢測器,SPD-M20A,日本島津儀器有限公司;溶劑輸送泵,LC-16,島津儀器(蘇州有限公司;柱溫箱,CTO-16,島津儀器(蘇州)有限公司;色譜柱,ODS Hypersil 250 mm×4.6 mm,5 μm,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        分別采用熱水煮提、超聲提取、果膠酶解和淀粉酶解法對猴頭菇多糖進(jìn)行提取。

        1.3.1 熱水煮提法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水,浸泡4 h,100 ℃煮提2 h后過濾,濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液,60 ℃水浴濃縮至200 mL,離心(4 500 r/min,10 min),棄去沉淀。向上清液加入4倍量無水乙醇,沉淀過夜。離心(4 500 r/min,10 min),收集沉淀。向沉淀中加入150 mL蒸餾水,充分溶解,重復(fù)醇沉1次。沉淀冷凍干燥,得猴頭菇多糖WHP。

        1.3.2 淀粉酶提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水,浸泡4 h,加入1 g淀粉酶60 ℃提取1 h后,煮沸10 min對酶進(jìn)行滅活,過濾,濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后,處理方式同熱水煮提法,最終得到多糖 WHP-D。

        1.3.3 果膠酶提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水,浸泡4 h,加入1 g果膠酶55 ℃提取1 h后,煮沸10 min對酶進(jìn)行滅活,過濾,濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后,處理方式同熱水煮提法,最終得到多糖 WHP-G。

        1.3.4 超聲提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水,浸泡4 h,超聲(300 W,40 ℃)提取0.5 h后過濾,濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后處理方式同熱水煮提法,最終得到多糖WHP-C。

        1.3.5 理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。

        單糖組成分析[11-13]:稱取多糖樣品2 mg,依次用1 mol/L鹽酸-甲醇溶液和2 M三氟乙酸溶液水解,PMP衍生化后HPLC檢測。采用Shimadzu HPLC系統(tǒng),Hypertsil ODS色譜柱,流動(dòng)相為82.0% PBS(0.1 mol/L,pH值7.0)和18.0%(體積分?jǐn)?shù))乙腈,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測波長為245 nm。

        1.3.6 多糖的DPPH清除率檢測 DPPH溶液的配制:5 mg DPPH,加入無水乙醇定容至100 mL,充分溶解,避光保存。

        取0.5 mL樣品溶液(空白對照為水),加入0.5 mL DPPH溶液,避光反應(yīng)1 h,517 nm處測吸光值[14]。

        DPPH清除率=(D對照-D樣品)/A對照×100%。

        D對照:空白對照管反應(yīng)后的吸光值;D樣品:樣品溶液反應(yīng)后的吸光值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同方式提取得到的猴頭菇多糖產(chǎn)率及單糖組成比較

        通過對不同提取方式得到的多糖產(chǎn)率及單糖組成進(jìn)行對比(表1),可以發(fā)現(xiàn),超聲法產(chǎn)率最低,果膠酶解和淀粉酶解次之,煮提法產(chǎn)率最高??偺呛肯嗖畈淮蟆?/p>

        猴頭菇多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)和甘露糖(Man)組成。煮提得到的多糖含有88.6%的Glc,超聲后得到的多糖中Glc含量為43.2%,果膠酶解和淀粉酶解提取得到的多糖Glc含量分別為86.8%和64.3%。超聲提取過程中,一些糖苷鍵被破壞,而使長鏈多糖成為短鏈寡聚片段,造成多糖提取效率較低,因此超聲法提取效率較低。并且與煮提相比,超聲提取法得到的多糖中Gal和Fuc的比例幾乎沒有變化,說明Gal和Fuc可能通過某些連接方式結(jié)合在一起,Glc含量的降低表明一些淀粉樣的葡聚糖鏈被打斷,成為寡聚片段在醇沉?xí)r被除去。

        相比之下,果膠酶解法得到的多糖不論從產(chǎn)率上還是單糖組成上,都與煮提法得到的多糖差異不大。這是因?yàn)楹镱^菇多糖本身含有的半乳糖醛酸(GalA)量很低,幾乎檢測不出來,果膠酶失去了作用點(diǎn),因此果膠酶提取法與煮提法相比沒有太大的差異。

        淀粉酶能夠水解α-1,4-Glc和α-1,4-Glc之間的連接鍵,因此淀粉酶解后得到的多糖中Glc含量明顯降低,Gal含量升高。雖然一些淀粉樣多糖被水解掉,但由于淀粉酶能夠打斷多糖通過Glc與細(xì)胞壁之間的連接,提高提取效率,所以整體產(chǎn)率并無太大變化。在試驗(yàn)中如果想要獲得猴頭菇多糖中的富含Gal的級分,可以考慮用淀粉酶解法。

        表1 不同提取方式得到的多糖產(chǎn)率和單糖組成

        2.2 猴頭菇多糖的抗氧化能力檢測

        DPPH自由基是一種物理性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)自由基,溶于乙醇后呈紫紅色,在517 nm處有最大吸收峰[15]。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),紫紅色隨反應(yīng)逐漸變?nèi)?,褪色程度與接受的單電子數(shù)呈正相關(guān)。反應(yīng)過程中DPPH的清除率可反映樣品清除自由基DPPH的能力。清除率越高,則樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。

        不同提取方式得到的猴頭菇多糖對DPPH的清除能力具有明顯差異(圖1)。不同提取方式得到的猴頭菇多糖都能一定程度上清除DPPH自由基,并具有一定的濃度依賴性。水提多糖WHP對DPPH的清除率較低。WHD-D和WHD-P差異不大,在濃度為1 mg/mL時(shí),清除率均能達(dá)到40%以上。WHP-C的濃度為1 mg/mL時(shí),清除率接近60%。當(dāng)多糖濃度小于等于0.8 mg/mL時(shí),WHP-D對DPPH清除的效果最好;當(dāng)多糖濃度大于0.8 mg/mL時(shí),WHP-C對DPPH清除的效果最好。因此,如果想得到抗氧化活性好的猴頭菇多糖,可以根據(jù)實(shí)際情況考慮利用淀粉酶解法或超聲提取法。

        3 討論與結(jié)論

        本研究對猴頭菇的提取工藝進(jìn)行了比較,并通過DPPH自由基清除試驗(yàn)驗(yàn)證了其抗氧化活性。煮提和果膠酶解法提取得到的多糖單糖組成相似,但果膠酶解后得到的多糖水溶性更好。淀粉酶解得到的多糖中Gal含量明顯高于其他幾組。而超聲提取得到的多糖Glc和Gal比例約為1 ∶1。通過熱水煮提得到的多糖產(chǎn)率最高,但抗氧化活性不明顯。淀粉酶解與果膠酶解得到的多糖產(chǎn)率相近,活性略有不同,低濃度時(shí)淀粉酶解多糖活性較好,高濃度時(shí)果膠酶解多糖活性更強(qiáng)。超聲提取得到的多糖產(chǎn)率最低,當(dāng)多糖濃度小于1 mg/mL時(shí)抗氧化效果最好。這可能是與多糖的溶解度相關(guān),不同提取方式得到的多糖溶解度排序?yàn)槌曁崛?淀粉酶提取>果膠酶提取>水提多糖。當(dāng)多糖濃度較低時(shí),溶解性越好的多糖抗氧化活性越明顯。本研究結(jié)果可以為猴頭菇多糖的提取及活性評價(jià)提供一定的指導(dǎo),也為猴頭菇多糖的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

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