李珊珊，王珊丹， 燕洪濤， 陳建波， 孫印石

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112； 2.吉林省人民醫(yī)院，吉林長春 130021； 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春 130041)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)別稱猴頭菌、刺猬菌，屬擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科猴頭屬[1]。在我國多地均有分布，尤其在長白山脈資源豐富，是一種非常具有特色的食用菌類。猴頭菇含有多種營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、氨基酸等[2]。多糖是猴頭菇的重要活性成分，已被證實(shí)具有保護(hù)胃黏膜[3]、增強(qiáng)免疫力[4-6]、抗腫瘤[7-9]、抗疲勞[10]等多種功效。關(guān)于猴頭菇多糖的研究已經(jīng)越來越受重視，但多以活性研究為主，提取方法和單糖組成研究較少，一定程度上限制了猴頭菇多糖的應(yīng)用。針對上述現(xiàn)狀，以猴頭菇為原料，分別比較了熱水煮提、超聲提取、果膠酶提取、淀粉酶提取5種提取方式對猴頭菇多糖的產(chǎn)率、總多糖含量和單糖組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇采購于吉林省長春市立新參茸特產(chǎn)超市；果膠酶、淀粉酶采購于河南正興食品添加劑有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品采購于Sigma-Aldrich公司；DPPH采購于Coolaber公司(Cat# CD4891-500MG)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

TGL-16A高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-1A-50低溫冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司；超聲波清洗機(jī)JP-100ST，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋HHS型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

高效液相色譜儀及色譜柱：紫外檢測器，SPD-M20A，日本島津儀器有限公司；溶劑輸送泵，LC-16，島津儀器(蘇州有限公司；柱溫箱，CTO-16，島津儀器(蘇州)有限公司；色譜柱，ODS Hypersil 250 mm×4.6 mm，5 μm，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

分別采用熱水煮提、超聲提取、果膠酶解和淀粉酶解法對猴頭菇多糖進(jìn)行提取。

1.3.1 熱水煮提法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水，浸泡4 h，100 ℃煮提2 h后過濾，濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液，60 ℃水浴濃縮至200 mL，離心(4 500 r/min，10 min)，棄去沉淀。向上清液加入4倍量無水乙醇，沉淀過夜。離心(4 500 r/min，10 min)，收集沉淀。向沉淀中加入150 mL蒸餾水，充分溶解，重復(fù)醇沉1次。沉淀冷凍干燥，得猴頭菇多糖WHP。

1.3.2 淀粉酶提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水，浸泡4 h，加入1 g淀粉酶60 ℃提取1 h后，煮沸10 min對酶進(jìn)行滅活，過濾，濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后，處理方式同熱水煮提法，最終得到多糖 WHP-D。

1.3.3 果膠酶提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水，浸泡4 h，加入1 g果膠酶55 ℃提取1 h后，煮沸10 min對酶進(jìn)行滅活，過濾，濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后，處理方式同熱水煮提法，最終得到多糖 WHP-G。

1.3.4 超聲提取法 50 g干燥的猴頭菇切成小塊后加入1 L蒸餾水，浸泡4 h，超聲(300 W，40 ℃)提取0.5 h后過濾，濾渣重復(fù)提取2次。合并3次提取所得濾液后處理方式同熱水煮提法，最終得到多糖WHP-C。

1.3.5 理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。

單糖組成分析[11-13]：稱取多糖樣品2 mg，依次用1 mol/L鹽酸-甲醇溶液和2 M三氟乙酸溶液水解，PMP衍生化后HPLC檢測。采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)，Hypertsil ODS色譜柱，流動(dòng)相為82.0% PBS(0.1 mol/L，pH值7.0)和18.0%(體積分?jǐn)?shù))乙腈，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為245 nm。

1.3.6 多糖的DPPH清除率檢測 DPPH溶液的配制：5 mg DPPH，加入無水乙醇定容至100 mL，充分溶解，避光保存。

取0.5 mL樣品溶液(空白對照為水)，加入0.5 mL DPPH溶液，避光反應(yīng)1 h，517 nm處測吸光值[14]。

DPPH清除率=(D對照-D樣品)/A對照×100%。

D對照：空白對照管反應(yīng)后的吸光值；D樣品：樣品溶液反應(yīng)后的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式提取得到的猴頭菇多糖產(chǎn)率及單糖組成比較

通過對不同提取方式得到的多糖產(chǎn)率及單糖組成進(jìn)行對比(表1)，可以發(fā)現(xiàn)，超聲法產(chǎn)率最低，果膠酶解和淀粉酶解次之，煮提法產(chǎn)率最高?？偺呛肯嗖畈淮蟆?/p>

猴頭菇多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)和甘露糖(Man)組成。煮提得到的多糖含有88.6%的Glc，超聲后得到的多糖中Glc含量為43.2%，果膠酶解和淀粉酶解提取得到的多糖Glc含量分別為86.8%和64.3%。超聲提取過程中，一些糖苷鍵被破壞，而使長鏈多糖成為短鏈寡聚片段，造成多糖提取效率較低，因此超聲法提取效率較低。并且與煮提相比，超聲提取法得到的多糖中Gal和Fuc的比例幾乎沒有變化，說明Gal和Fuc可能通過某些連接方式結(jié)合在一起，Glc含量的降低表明一些淀粉樣的葡聚糖鏈被打斷，成為寡聚片段在醇沉?xí)r被除去。

相比之下，果膠酶解法得到的多糖不論從產(chǎn)率上還是單糖組成上，都與煮提法得到的多糖差異不大。這是因?yàn)楹镱^菇多糖本身含有的半乳糖醛酸(GalA)量很低，幾乎檢測不出來，果膠酶失去了作用點(diǎn)，因此果膠酶提取法與煮提法相比沒有太大的差異。

淀粉酶能夠水解α-1，4-Glc和α-1，4-Glc之間的連接鍵，因此淀粉酶解后得到的多糖中Glc含量明顯降低，Gal含量升高。雖然一些淀粉樣多糖被水解掉，但由于淀粉酶能夠打斷多糖通過Glc與細(xì)胞壁之間的連接，提高提取效率，所以整體產(chǎn)率并無太大變化。在試驗(yàn)中如果想要獲得猴頭菇多糖中的富含Gal的級分，可以考慮用淀粉酶解法。

表1 不同提取方式得到的多糖產(chǎn)率和單糖組成

2.2 猴頭菇多糖的抗氧化能力檢測

DPPH自由基是一種物理性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)自由基，溶于乙醇后呈紫紅色，在517 nm處有最大吸收峰[15]。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，紫紅色隨反應(yīng)逐漸變?nèi)?，褪色程度與接受的單電子數(shù)呈正相關(guān)。反應(yīng)過程中DPPH的清除率可反映樣品清除自由基DPPH的能力。清除率越高，則樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。

不同提取方式得到的猴頭菇多糖對DPPH的清除能力具有明顯差異(圖1)。不同提取方式得到的猴頭菇多糖都能一定程度上清除DPPH自由基，并具有一定的濃度依賴性。水提多糖WHP對DPPH的清除率較低。WHD-D和WHD-P差異不大，在濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率均能達(dá)到40%以上。WHP-C的濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率接近60%。當(dāng)多糖濃度小于等于0.8 mg/mL時(shí)，WHP-D對DPPH清除的效果最好；當(dāng)多糖濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，WHP-C對DPPH清除的效果最好。因此，如果想得到抗氧化活性好的猴頭菇多糖，可以根據(jù)實(shí)際情況考慮利用淀粉酶解法或超聲提取法。

3 討論與結(jié)論

本研究對猴頭菇的提取工藝進(jìn)行了比較，并通過DPPH自由基清除試驗(yàn)驗(yàn)證了其抗氧化活性。煮提和果膠酶解法提取得到的多糖單糖組成相似，但果膠酶解后得到的多糖水溶性更好。淀粉酶解得到的多糖中Gal含量明顯高于其他幾組。而超聲提取得到的多糖Glc和Gal比例約為1 ∶1。通過熱水煮提得到的多糖產(chǎn)率最高，但抗氧化活性不明顯。淀粉酶解與果膠酶解得到的多糖產(chǎn)率相近，活性略有不同，低濃度時(shí)淀粉酶解多糖活性較好，高濃度時(shí)果膠酶解多糖活性更強(qiáng)。超聲提取得到的多糖產(chǎn)率最低，當(dāng)多糖濃度小于1 mg/mL時(shí)抗氧化效果最好。這可能是與多糖的溶解度相關(guān)，不同提取方式得到的多糖溶解度排序?yàn)槌曁崛?淀粉酶提取>果膠酶提取>水提多糖。當(dāng)多糖濃度較低時(shí)，溶解性越好的多糖抗氧化活性越明顯。本研究結(jié)果可以為猴頭菇多糖的提取及活性評價(jià)提供一定的指導(dǎo)，也為猴頭菇多糖的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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